实验三 基因的PCR扩增技术

实验三基因的PCR扩增技术一、实验目的学习PCR反应的基本原理与实验技术从BCG基因组DNA中PCR扩增Rv1791（PE19）基因二、基本原理PCR类似于DNA的天然复制过程。将待扩增的DNA片段与其两侧互补的两段寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增倍数可达2n倍。体内DNA的复制DNA聚合酶dNTP解旋酶类引物5’3’加热变性复性复温DNA的变性和复性加热或强酸、碱性作用可以使DNA双螺旋的氢键断裂,双链解离,形成单链DNA,这称为DNA的变性。解除变性的条件后,变性的单链可以重新结合起来,形成双链,其原有的特性和活性可以恢复,这称DNA复性,也叫退火。PCR扩增原理引物延伸延伸5’5’3’3’变性、退火变性、退火总体积25-100lBuffer缓冲液dNTP原料Primer引物DNA分子模板Taq酶DNA聚合酶1反应体系三、实验材料BCG基因组DNA10PCR反应缓冲液、4dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、引物（P1、P2）、超纯水SWPCR反应管、移液器、PCR仪、离心机四、实验步骤引物设计准备PCR反应溶液PCR扩增反应结果检测Rv1791-F：ATGAATTCAGGAAGACAGCATGTCGTTC（EcoRI）Rv1791-R：ATCTCGAGTGTTCCCCCTCTCCTTCAG（XhoI）（二）准备PCR反应溶液10×PCR反应缓冲液2.5μl4×dNTPs2.0μl引物P11μl（10nM）引物P21μl模板DNA2μlTaqDNA聚合酶0.2μl用无菌去离子水至25μl↓用手指轻弹PCR反应管管底部，使溶液混匀↓在台式离心机中离心2秒以集中溶液于管底在PCR仪中设计如下反应程序：94C、5min；94C、30sec，61C、40sec，72C、30sec，30个循环；72C、5min（三）PCR扩增反应将已混匀的PCR反应管置于PCR仪的反应孔中，盖好盖子进行反应。反应完毕，将样品取出置于冰浴中待用（四）结果检测本PCR扩增的产物DNA片段长度为300bp，适合于在1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳检测。从每个反应管中取5ulPCR产物进行电泳检测。12345循环94℃30s56.5℃40s72℃60s94℃30s57.7℃40s72℃6094℃30s58.6℃40s72℃60s94℃30s59.9℃40s72℃60s94℃30s61.1℃40s72℃60s五、思考题影响PCR结果的因素。