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2020/1/281茎尖培养与微体快繁意义：解决快繁和脱毒微体繁殖的技术与方法（微体繁殖一般分为四个步骤）：I—无菌培养的建立II—繁殖体的增殖（兼热处理）III—芽苗的生根IV—小植株的驯化移栽2020/1/282一、茎尖培养程序茎尖培养的含义比较广泛，包括小的仅仅10-100um的茎尖分生组织，大的几十毫米的茎尖或更大的芽的培养。一般来说，材料体积小或不带叶原基的培养较困难，成苗所需要的时间长，而培养材料体积大的容易培养成功。茎尖培养在园艺植物离体培养中是最常采用的材料之一，它在园艺植物的无性系快速繁殖、无毒苗的培养，品种改良和基础理论研究都有着重要的意义。2020/1/283（一）建立无菌材料按照离体培养的基本操作方法，对外植体的选择原则，严格挑选茎尖培养材料，从健康植株上选取健壮的枝梢，除去叶片，用自来水冲洗污物，再进行消毒处理。常用消毒剂：消毒剂既要有良好的消毒效果，又要易被无菌水冲洗掉或能够自行分解的物质，而且不会损伤材料，影响生长。2020/1/284消毒剂使用原则防止伤害材料，经常采用少量多次，或多种药剂交替使用。2020/1/285几种常用的灭菌方法：茎尖、茎段及叶片等的消毒：流水冲洗—去污粉洗涤—酒精消毒—无菌水冲洗—升汞灭菌—无菌水冲洗果实及种子的消毒：流水冲洗—酒精消毒—无菌水冲洗—升汞灭菌—无菌水冲洗2020/1/286花药消毒：酒精消毒—无菌水冲洗—漂白粉浸泡—无菌水冲洗根及地下部器官的消毒：流水冲洗—去污粉洗涤—去除损伤部位—吸干水分—纯酒精漂洗—无菌水冲洗—升汞灭菌—无菌水冲洗2020/1/287顶端分生组织是指茎的最幼龄叶原基上方的部分，最大直径约为100μm，最大长度约为250μm。茎尖是指顶端分生组织及其下方的1-3个幼叶原基。通过顶端分生组织培养消除病毒的几率高，但多数无毒植株都是通过培养茎尖外植体（250-1000μm）得到的。2020/1/288茎尖区域应是无菌的，但一般在切取外植体之前需对茎芽进行表面消毒。叶片包被紧实的芽（如菊花、菠萝、姜和兰花等）只需在75％酒精中浸蘸一下即可。叶片包被松散的芽要用0.1％次氯酸钠溶液表面消毒10min。2020/1/289材料的接种接种外植体大小，根据不同植物材料及培养目的而异，可以切取整个芽或带茎段接种，也可以剥取0.2-0.5cm的茎尖。脱毒苗的培养往往取0.1cm以下茎尖分生组织进行接种。2020/1/2810茎尖培养脱毒病毒分布并不均匀，病毒的数量随植株的年龄与部位而异，越靠近茎顶端区域的病毒的浓度也越低，分生区域内无维管束，病毒只能通过胞间连丝传递，赶不上细胞的不断分裂和活跃的生长速度，所以生长点含有的病毒数量极其微少，因此剪切的茎尖愈小愈佳，但太小时不易成活，过大则不能保证完全除去病毒，不同种类植物和不同种类病毒在茎尖培养时切取的茎尖大小也不相同。2020/1/28112020/1/2812材料的分离、切取和接种：切割动作要快，防止材料受损；防止交叉污染；接种材料要均匀；作好标记。2020/1/2813茎尖培养常用的培养基为MS基本培养基，并根据园艺植物的不同种类添加附加物，包括不同种类及其浓度的植物生长调节剂。将茎尖接种于培养基上，放在每天光照12h，温度25±2℃的培养室进行培养。经过2-3周培养，便可以建立起无菌培养材料体系，供进一步试验用。2020/1/2814（二）茎尖的发育方向及其调节培养的茎尖可能有几种不同的发育方向：（1）腋芽萌发（2）脱分化后产生胚状体（3）脱分化后直接产生不定器官（4）脱分化后形成愈伤组织上述前三个发育方向，均可进行离体繁殖。脱分化的愈伤组织，用作悬浮细胞或原生质体的起始材料，或用以分化大量胚状体，或不定芽。2020/1/2815在植物茎尖培养时，其可能向哪一个方向发展，与外植体的大小有关，采用微型外植体或分生组织，通常趋向于形成愈伤组织，与各种培养条件也有关系，但是培养基内的植物生长调节剂的种类和浓度关系最密切。2020/1/2816通常加入一些细胞分裂素和生长素并调节两者的配比，是调节茎尖发育方向的关键采用细胞分裂素KT、6-BA或ZT与IBA、NAA或2,4-D进行配比试验。茎尖在不同的处理组合中的有不同发育趋势。据此，可以确定调节茎尖发育方向及其增殖的较佳生长调节剂组合。2020/1/2817热处理脱毒为了克服茎尖培养脱毒法带来的弊病，提高脱毒效率，热处理脱毒法与茎尖培养脱毒法结合。植物组织处于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热之后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。2020/1/2818愈伤组织热处理植物组织处于高于正常温度的环境中，组织内部的病毒受热以后部分或全部钝化，但寄主植物的组织很少或不会受到伤害。但每种植物都有其临界温度范围，超过这一临界范围或在此范围内处理时间过长，都会导致寄主植物组织受伤。为此可使用变温的处理方法，高（40℃）和低温（16-20℃）交替处理，既能保证植物材料不受伤害，又能除去病毒。2020/1/2819反复继代兼热处理，经历一定的时间（继代次数需试验）后，将热处理过的愈伤组织转移到分化培养基中，诱导器官分化。2020/1/2820（三）器官分化成苗刺激胚状体发生，直接萌发成完整小苗单向刺激，先长腋芽和不定芽再转入生根培养基培养成苗。2020/1/2821芽苗生根，不同植物种类难易不一，对难生根植物可采用：①降低基本培养基无机盐浓度，一般采用1/2MS或改良White基本培养基②调节生长素浓度，采用IBA或NAA0.1-0.5mg/L有利于分化根③添加吸附剂，一般认为加入适量的活性炭有利于长根④减少琼脂用量，以支持小苗生长为度，可能有利于长根2020/1/2822茎尖培养的生长可能有4种类型①组织不增大，不久变褐死亡，可能生长点受伤②组织间变绿，但增大缓慢，可能生长素浓度太低，提高温度③组织基部不产生或少量产生愈伤组织，生长点发育正常，1个月内形成无根植株—最佳④茎尖基部产生大量愈伤组织而生长点很少生长，不理想，应促其分化2020/1/2823（四）试管苗驯化移栽试管苗的移栽应该在生根后不久，当小根尚未停止生长之前及时移植。移植前要加强光照，打开瓶盖进行炼苗，使小苗逐渐适应外界环境。移苗除了注意苗床基质保持疏松外还要合理调控温度，才能保证小苗成活。2020/1/2824（五）再生植株的鉴定（病毒鉴定）1.直观测定法直接观察植株茎叶有无这一病毒可见的症状特征是一种最简便的方法。然而在寄主植物上感染病毒后出现症状需要较长时间，还有的不使寄主植物表现可见症状，因此需要更敏感的测定方法。2.指示植物法3.抗血清鉴定法4.电子显微镜观察法2020/1/2825本章结束