应用mRNA定量分析方法评价药物对肝CYPs酶的诱导作用

受试物诱导一个或多个人肝CYPs酶，增加合用药物或自身的代谢清除率，降低合用药物或自身的药效受试物诱导的代谢途径使得反应性代谢产物增加，从而导致直接或间接毒性国家食品药品监督管理局药品审评中心：药物相互作用研究指导原则，2009(=showGuide&id=288)2012(=largePage&id=147)FDA指导原则草稿本：DrugInteractionStudies—StudyDesign,DataAnalysis,ImplicationsforDosing,andLabelingRecommendations，2012()需测定的人肝CYPs酶CYP1A2，CYP2B6和CYP3A4CYPs酶诱导的主要作用机制是基因转录水平的提高，通过核受体介导CYP1A2：芳香烃受体(AhR)CYP3A，CYP2C和CYP2B：孕烷X受体(PXR)CYP2B6：组成型雄甾烷受体(CAR)介导描述CFDA2009，2012年指导原则FDA2012年指导原则评价体系新鲜分离的或冷冻保存的人肝细胞（至少3个志愿者）永生化人肝细胞新鲜分离的或冷冻保存的人肝细胞（至少3个志愿者）评价的CYPs酶最先CYP1A2和CYP3A4适当时CYP2B6在CYP3A4不诱导时不考虑CYP2C8，2C9和CYP2C19最先CYP1A2，CYP2B6和CYP3A4若CYP3A4诱导，评价CYP2C8，2C9和CYP2C19终点仅活性，可以细胞也可以制备微粒体仅mRNA阳性2倍4倍特殊考虑代谢产物大于母体AUC的25%时，需要单独考察细胞贴壁适应2天收获细胞测定诱导诱导2天CYPs诱导剂推荐的浓度（µM）诱导倍数（活性）CYP1A2奥美拉唑25-10014-24CYP2B6苯巴比妥500-10005-10CYP2C，CYP3A4利福平10-504-311.mRNA测定2.活性测定3.细胞毒性总RNA有三大类：信使RNA（mRNA），核糖体RNA（rRNA），转运RNA（tRNA）信使RNA：携带从DNA编码链得到的遗传信息，并以三联体读码方式指导蛋白质生物合成，约占细胞RNA总量的3%～5%转运RNA：具有结合体功能和信息传递功能核糖体RNA：是合成蛋白质的场所反转录PCR(RT-PCR)原理：以RNA作为模板，加入随机引物，利用反转录酶反转录成cDNA；以cDNA为模板进行指数扩增反转录PCR示意图采用Taqman探针检测的模式Ct值目标基因CYP1A2，CYP2B6和CYP3A4内参基因的选择18s，GAPDH，β-actin，HPRT荧光定量SYBRGreen和Taqman方法的选择引物和探针的设计——PrimerPremier引物是PCR实验成败的关键因素提取肝细胞总RNA采用RT-PCR将RNA反转录为cDNA加入CYP1A2，CYP2B6和CYP3A4的引物和探针，Real-timePCR定量分析比较受试物组，诱导剂组和溶剂对照组mRNA表达量的变化第五天的贴壁细胞——异硫氰酸胍-酚-氯仿法TransferTransferAqueousPhase测定230nm，260nm，280nm，和320nm下的吸光度OD230nm代表盐浓度的吸光度值OD260nm代表核酸的吸光度值OD280nm代表蛋白质的吸光度值OD320nm代表背景的吸光度值OD260/OD280反映RNA的纯度，应在1.8-2.2之间RNA的浓度=（OD260/OD320）×稀释倍数×0.04µg/µLRNA的浓度约150ng/µLRNA完整性鉴定RNA6µL反应缓冲液8µL反转录酶1µL反转录随机引物4µL焦碳酸二乙酯水（DEPC水）1µL反转录PCR反应反应体系为20µL，37℃15min合成的cDNA可以在-20℃长期保持普通PCR仪-AB2720ThermalCyclerRealTimePCR反应两步法PCR扩增标准程序1.预变性，95℃30s；2.PCR反应，95℃5s，60℃30s，40个循环组分体积cDNA（稀释）2µLPCR上游引物0.4µLPCR下游引物0.4µLTaqDNA聚合酶10µLTaqman荧光探针溶液0.4µL灭菌水6.6µLROX0.2µL总量20µL荧光定量ABI7500PCRSystem实验配置标准曲线，表征反应在线性范围内进行及具有足够的扩增效率CYP1A2的标准曲线决定系数=0.993扩增效率=98.266%18s的标准曲线决定系数=0.999扩增效率=92.664%内参基因目标基因__TCTCTC−=∆对照组诱导组__TCTCTC∆−∆=∆∆TC∆∆=-2诱导倍数实验采用2-△△Ct方法来分析目标基因在受试物组与溶剂对照组表达量的相对变化目标基因：CYP1A2，CYP2B6或CYP3A4内参基因：18s或GAPDH等诱导组：经奥美拉唑，苯巴比妥，利福平或受试物诱导对照组：溶剂对照-2，表示诱导倍数大于4倍，提示诱导的存在TC∆∆1.给药-体外探针药物细胞培养至96h，弃含诱导剂的给药培养液，加入含探针底物非那西丁(CYP1A2)，丁胺苯丙酮(CYP2B6)和睾酮(CYP3A4)的培养液，37°C，5%二氧化碳培养箱中孵育1小时2.终止反应将培养液从培养板中取出并转移到96孔板中，加入含有内标的乙腈溶液处理样品CYPs底物反应CYP1A2非那西丁(50µM)非那西丁O-脱烷基化CYP2B6丁胺苯丙酮(50µM)丁胺苯丙酮2-羟基化CYP3A4睾酮(50µM)睾酮6ß-羟基化各底物生成代谢物的速率表征CYPs活性应用已验证的LC-MS/MS分析方法测定生成的相应代谢物的浓度6个标准样品，3个质控浓度，除LLOQ的相对偏差在±20%外，其余在±15%流动相0.01%甲酸水溶液和0.01%甲酸乙腈溶液CYPs代谢物离子对(m/z)内标离子对(m/z)CYP1A2对乙酰氨基酚152.1-110.1对乙酰氨基酚-d3155.0-111.0CYP2B62-羟基丁胺苯丙酮256.3-238.02-羟基丁胺苯丙酮-d6262.3-244.0CYP3A46β-羟基睾酮305.2-269.26β-羟基睾酮-d7312.2-276.1质谱仪:ABMDXSciexAPI-4000LC-MS/MS液质联用系统离子化方法:电喷雾离子源(ESI)对乙酰氨基酚2-羟基丁胺苯丙酮6β羟基睾酮1.计算细胞CYPs活性用代谢物生成率来表示代谢物生成率（pmol/min/well）=Cmet：受试物或诱导剂诱导后细胞生成代谢产物的浓度Ccontrol：溶剂对照组的细胞生成代谢产物的浓度2.%相对阳性对照组活性的增加3.诱导倍数的计算诱导倍数=1.受试物存在体外诱导潜能的判断标准：酶诱导的后续预测终点:产生变化等于或大于阳性对照活性40%的药物被认为是酶诱导剂，应进行体外和体内评价CytochromeP4503A4mRNAisaMoreReliableMarkerthanCYP3A4ActivityforDetectingPregnaneXreceptor-ActivatedInductionofDrug-MetabolizingEnzymes.DrugMetabolismandDisposition,38:1605-1611,2010CYPs活性40%CYPsmRNA42.InVitrotoinVivoExtrapolation（IVIVE）40%,简单而有效的判断标准观点：15%,不可能；15-40%，可能；40%极可能诱导剂体内血药浓度相对利福平的诱导倍数已报告的临床相互作用利福平10-29µM100%65苯妥英40-80µM80%~20苯巴比妥65-150µM≤40%地塞米松2µM≤10%~5奥美拉唑5µM0%~13.活性测定40%,mRNA445例受试物诱导评价，无1例存在mRNA测定结果呈现阴性，而活性结果呈现阳性mRNA测定更加敏感，减少了诱导假阴性的几率可以进一步体外的研究结果比较mRNA-阳性mRNA-阴性活性-阳性50活性-阴性7334.体外评价-有诱导潜能1.增加受试物浓度至6-8个，测定Emax和EC50，计算R值，并与阳性诱导剂的EC50比较2.应用机制性模型或动力学PKPB的模型，计算AUCR值3.临床药物相互作用研究若代谢物的AUC大于母体药物AUC的25%，该代谢物也需要进行抑制和诱导实验，测定是否存在药物相互作用潜能“检查药物浓度应以所用人类血药浓度为依据。至少对治疗范围的三个浓度进行研究，包括至少一个大于平均预测血药浓度一个数量级的浓度。如果未得到该信息，那么应对至少两个数量级范围内的浓度进行研究。”SFDA指导原则2009美新诺的设计：三个受试物的浓度，跨越人Cmaxss，如果溶解度允许的话，最高点设为10×Cmaxss如果有游离和结合的受试物浓度，应用总的血浆浓度，以保证足够的暴露量受试物的浓度选择需要考虑细胞毒性选择1——进行预实验，了解受试物对肝细胞的毒性范围，避开毒性浓度选择2——在诱导实验第一个批号肝细胞时，应用较广的浓度范围，第2，3个批号时选用合适的浓度020406080100120140160LDH-%相对活率0Hour24Hour48Hour72HourCmax与酶活性测定法比较：1.mRNA方法呈现更少的假阴性2.mRNA方法可以发现既有诱导作用又有抑制作用的化合物3.cDNA可以长期保存，方便后续的实验（CYP2B和CYP2C）南京医药科技有限公司