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第三节发酵条件的影响及其控制引言影响发酵的因素较多，有些因素还是未知的，此外其主要影响因素也会变化。因此了解发酵工艺条件对过程的影响和掌握反映菌的生理代谢和发酵过程变化的规律，可以帮助人们有效地控制微生物的生长和生产。常规的发酵条件有：罐温、搅拌转速、搅拌功率、空气流量、罐压、液位、补料、加糖、油或前体，近氨速率以及补水(需要的话)等的设定与控制。微生物的发酵水平取决于菌种的特性和发酵条件（包括培养基）的控制。1、基质浓度对发酵影响及其控制（主要内容第四章）基质浓度指发酵液中糖，氮，磷与重要营养物质的浓度。基质浓度的变化对产生菌的生长和产物的合成有重要影响，也是提高代谢产物产量的重要控制手段。2、灭菌情况（主要内容第四章）一般随着灭菌温度升高和时间延长，对培养基的破坏作用增强，从而影响产物的合成。。氨基化合物（氨基酸、肽、蛋白质）容易与羰基化合物发生复杂的美拉德反应，在导致培养基褐变同时，还降低了有关的营养物成分。糖类化合物可以低压灭菌（115oC,15min）某些不耐热的成分有时可以过滤除菌法除菌。葡萄糖不宜与其他养分一起灭菌，最好单独灭菌。3、种子质量（主要内容第六章）发酵期间菌种生长的快慢和产物合成的多少在很大程度上取决于种子的质量。a.接种菌龄：一般对数生长期后期，最适菌龄由试验确定b.接种量：一般接种量5-10%，抗生素接种量可以增加到20-25%4、温度对发酵的影响（1）温度对微生物生长的影响微生物的生长和产物合成均需在各自合适的温度下进行，有时候这两个温度并不一致。dXXXdt-比死亡速率'lnln/lnln/aaAERTAERT①②③几乎所有微生物的脂质成分随温度变化（2）温度对发酵的影响a.温度影响生物合成的方向：低于30℃合成金霉素能力较强四环素比例上升35℃只产四环素金色链霉菌b.温度对代谢的调节低于20℃时，氨基酸合成途径的终产物对第一个酶的反馈抑制比在正常生长温度（20℃）更大。（3）最适温度的选择整个发酵周期采用一个温度未必最好。青霉素产生菌最适生长温度30℃最适发酵温度20℃①选择那个温度，要看当时菌体生长和生物合成这一对矛盾中哪一个为主要方面。菌体生长为主青霉素合成为主②温度的选择还要考虑其他发酵条件供氧差-适当降低温度稀薄或容易利用的培养基-适当降低温度……（4）发酵罐温度的控制夹套（10m3以下）盘管（蛇管）（10m3以上）夹套盘管（蛇管）5、pH对发酵的影响（1）不同微生物的生长pH最适范围(一般规律):微生物最佳生长pH范围耐受的pH上下限霉菌5-75-8.5酵母4-53.5-7.5细菌、放线菌6.5-7.53-8.5(2)发酵过程pH变化的原因a.生理酸性或碱性物质的存在：硫酸铵、硝酸钠b.发酵过程中有机酸的积累：乳酸、丙酮酸、乙酸（3）微生物生长和产物合成阶段的最适pH值通常不一致，这不仅与菌种有关，还与产物化学性质有关。黑曲霉合成柠檬酸（三元酸）的最适pH值在3.5-4金色链丝菌合成金霉素和四环素（两性化合物）的最适pH值5.9-6.3产黄青霉菌合成青霉素（弱酸）的最适pH值在6.5-6.8（4）最适pH的选择最适pH的选择准则是获得最大比生产速率和适当的菌体量，以获得最高产量。在实际操作中应按发酵过程的不同阶段分别控制不同的pH范围。实例：S.mobaraense发酵法生产谷氨酰胺转氨酶（5）pH的控制a.调节基础培养基的配方调节碳氮比（C/N）添加缓冲剂如CaCO3b.补料控制–直接加酸、加碱–补加碳源或氮源6、溶氧对发酵的影响（1）为何要控制溶氧大多数发酵过程是好氧的，因此需要供氧。如果考虑呼吸的化学计量，则葡萄糖的氧化可由下式表示：C6H12O6十6O2＝6H2O十6CO2只有当这两种反应物均溶于水后，才对菌体有用。氧在水中的溶解度比葡萄糖要小约6000倍左右(氧在水中的饱和度约为l0mg/L)。许多发酵的生产能力受到氧利用限制，因此氧成为影响发酵效率的重要因素。发酵行业的测氧电极必须经的起高压蒸汽灭菌和具有长期的稳定性。（2）临界氧发酵生产中用空气饱和度百分数来表示溶氧浓度。临界氧浓度：指不影响菌体呼吸所允许的最低氧浓度。如对产物而言，便是不影响产物合成所允许的最低浓度。呼吸临界氧浓度不一定与产物合成临界氧浓度一致。产物合成临界氧浓度并不等于其最适氧浓度。在好氧培养过程中，并非维持溶氧越高越好。（抗生素发酵尤为明显）（3）发酵过程的溶氧变化（一般规律）发酵前期：由于微生物大量繁殖，需氧量不断大幅度增加，此时需氧超过供氧，溶氧明显下降发酵中后期，溶氧浓度明显地受工艺控制手段的影响，如补料的数量、时机和方式等发酵后期由于菌体衰老，呼吸减弱，溶氧浓度也会逐步上升，一旦菌体自溶，溶氧就会明显地上升（4）溶氧作为发酵异常的指示有些操作故障或事故引起的发酵异常现象也能从溶氧的变化中得到反映。如发酵罐故障或忘记开启转动中间补料是否得当可以从溶氧的的变化看出污染杂菌发酵前面2-5小时迅速跌到零附近，长时间不回升作为质量控制的指标天冬氨酰胺酶发酵好氧厌氧DO=45%赤霉素发酵中“发酸”现象（5）溶氧的控制/(*)LLdcdtKaCC④a.从供氧角度考虑为单位时间内发酵液中氧浓度的变化（mmol/(L·h)）为氧传质系数(m/h)为比界面面积(m2/m3)为氧在水中的饱和浓度（mmol/L）为发酵液中的溶氧浓度（mmol/L）/dcdtLKa*CLC凡是能增加和C*的措施都能改善发酵供氧LKaLKa体积传氧系数（h-1）在通气中掺入纯氧或富氧不宜长时间使用提高罐压CO2分压提高，影响菌体改变通气速率气流速度较低时适用㈠增加C*的方法:可以提高设备供氧能力(搅拌桨、挡板的设计、转速)P170表7-7LKa㈡增加b.从需氧角度考虑2OQX⑤摄氧率（mmol/(L·h)）呼吸强度（mmol/(g·h)）菌体浓度（g/L）2OQX当发酵液中溶氧暂时处于稳态时，供氧速率=耗氧速率，即2(*)LLOKaCCQX⑥很显然，那些使这一方程失去平衡的因素也会影响溶氧浓度。㈠培养基成分丰富程度的影响限制性基质可以控制菌体生长，提高溶氧㈡温度影响降低温度可以增加C*，使供养方程推动力（C*-CL）增强㈢在菌体摄氧速率达到最大时，可以用富氧的方法提高气体中氧的含量溶氧只是发酵参数之一，它对发酵的影响必须结合其它参数（泡沫、菌丝形态、CO2的排除等）配合起来分析。研究发酵过程中溶氧规律，改变设备或工艺条件，配合其它参数使用。（7）泡沫对发酵的影响1、泡沫产生的原因与影响☺由外界引进的气流被机械地分散形成（通风、搅拌）；☺发酵过程中产生的气体聚结生成。❉降低发酵设备的利用率（装料系数一般取0.7）❉增加了菌群的非均一性❉增加了染菌的机会❉导致产物的损失❉消泡剂会给后提取工序带来困难发酵中泡沫危害发酵液中的蛋白质和细胞本身具有稳定泡沫的作用。2、发酵过程中泡沫的消张规律发酵过程中泡沫的多少受到多种因素影响。a.通气搅拌的剧烈程度和培养基成分玉米浆、蛋白胨、花生饼粉、黄豆饼粉、酵母膏、糖蜜是发泡的主要原因。b.灭菌的方法、时间、温度110→135℃，30min，生成蛋白黑色素和5-羟甲基（呋喃醇）糠醛c.发酵过程中发酵液的性质随菌体代谢活动不断变化，是泡沫消张的重要因素菌体、培养基浓度、粘度、营养物丰富程度3、泡沫的控制工业上消除泡沫常用的方法有两种：机械消泡和化学消泡（消泡剂消泡）a.机械消泡靠机械力引起强烈振动或者压力变化，促使泡沫破裂，或借机械力将排出气体中的液体加以分离回收。优点：不需要引进外界物质、节省原材料、减少污染机会缺点：不能从根本众消除引起稳定泡沫的因素b.化学消泡（消泡剂消泡）发酵工业常用的消泡剂有天然油脂类、聚醚类、高级醇类、硅酮类天然油脂类：豆油、玉米油、棉籽油（可做碳源）消泡能力强不是太强聚醚类：聚氧丙烯甘油、聚氧乙烯氧丙烯甘油（泡敌）泡敌消泡能力强，维持时间短高级醇类：十八醇、聚二醇聚二醇消泡效果持久硅酮类：聚二甲基硅氧烷及其衍生物不溶于水，单独使用较差，常与分散剂（微晶SiO2）一起使用使用方法：a.消泡剂的分散可以借助于机械方法或某种分散剂b.消泡作用的效果还与消泡剂加入时机和加入量相关油脂的加入c.过量的消泡剂会影响菌体采用一种对微生物生理和产物合成影响小，消泡效果好且成本低廉的消泡剂（8）发酵终点的判断不同类型的发酵，要求达到的目标不同，因此对发酵终点的判断标准也有所不同。a.一般对发酵及原料成本占整个生产成本主要部分的发酵品种，主要追求提高产率kg/(m3•h)得率（产物kg）/（基质kg）发酵系数（产物kg）/[(罐容积m3)•(发酵周期h)]b.对下游提炼成本占整个生产成本主要部分和产品价值高的发酵品种，除要求高产率和高发酵系数外，还要求高的产物浓度，如计算（产物g）/[(发酵液体积L)•(总的发酵时间h)]TDLtt-t-放罐检修时间洗罐时间打料、灭菌和生长延滞时间总生产率最大生产率发酵终止TtDtLt细胞或产物浓度(g/L)时间（h）⊙（产物g）/[(发酵液体积L)•(总的发酵时间h)]体积产率判断放罐的指标主要有产物浓度、过滤速度、菌体形态、氨基氮、pH、溶氧、发酵液的粘度和外观。⊙（9）发酵染菌的防治和处理1、染菌途径的分析2、染菌的判断与防治镜检染菌初期由于杂菌数目少，较难判断无菌试验一般要10h以后溶氧变化对目标菌发酵规律有一定的了解§原料性状原料预处理对于灭菌易结块的淀粉培养基以实罐灭菌为好，升温阶段加入α-淀粉酶§加强对设备和管道“死角”的灭菌加强清理并定期清除污垢§严格控制灭菌要求温度和时间§选用优质材料，并经常检查设备、管道、阀门§加强生产技术和管理对克服染菌至关重要染菌的判断染菌的预防