搜索
2013--2014学年第1学期生命科学学院期末考试卷《药物化学》学号:201172020144姓名:张明艳班级:11级-生物技术成绩：评语：（考试题目及要求）：见附页通篇修改诸如红色标出的全文翻译不当按照模版修改全文格式图居中使用短肽作为构建块层-层聚合物表面的生物分子大会摘要：通过层-层组装成多层膜掺入低分子量药物和治疗肽组装成单层膜有可能提供技术手段到目标网站，并提供小分子来调整释放他们。这项研究描述了使用具有疏水性和静电的相互作用，将一十三肽的抗炎激素，促黑色素细胞刺激素（α-MSH），作为在基地构建基块多层透明质酸、壳聚糖（CS）的程序集的乳酸-羟基酸PLGA曲面，一系列交换层，包括一个中性脂质DOPC，带负电荷的脂质混合物DOPC/DOPS和带负电荷的多糖HA，通过考察他们的能力，来支持后续的HA和CS层，分子动力学模拟进行审查α-MSH在溶液中及其表面上的结构和表面化学性质，提供了条件最有可能用来支持多层组装。多层组装大会稳定在生理PH下，并已成功地应用于颗粒物系统。目录1.简介2.材料与方法2.1.石英晶体微天平测量2.1.1.羟基乙酸共聚物膜的制备2.2.PLGA微球的生产2.3傅里叶变换红外显微镜2.4.圆二色性2.5.分子动力学模拟2.6.层由层程序集与PLGA生物分子的微球2.7.共焦激光扫描显微镜3.3.1.嵌入α-MSH的成多层膜3.2Α-MSH对PLGA膜的吸附3.3.α-MSH的二级结构3.4.α-MSH在溶液中的分子动力学模拟3.5.MD的α-MSH在疏水表面上的模拟3.6.层的层的程序集3.7.翻译到3D曲面4.结论1.简介层-层（LBL）组件是一个多用途的技术，它能通过互补的化学作用力将材料相继地沉积下来从而形成多层膜材料，一系列的相互作用，包括静电引力，氢键，DNA杂交，化学反应和疏水相互作用已被用来生产多层材料.例如多样性允许广泛的材料，包括合成的生物聚合物（带电和不带电），无机或金属纳米颗粒，蛋白质和小分子制造有功能的层层材料已被用于各个领域，特别是在生物材料领域，药物控释和组织工程。我们最近使用层—层技术提供碱性成纤维细胞生长因子，利用这种生长因子和高度硫酸化多糖类之间互动的强大和良好的特点，使嵌入于多糖层的生长因子的释放率周期减短到60天。许多新开发的药物的性能对层—层技术提出了新的未来发展的挑战，许多小且疏水的短肽衍生物都是有限充电的。这样的小分子通过层—层膜的扩散意味着他们不能得到充分和直接的层内纳入，提供有限的控制超过他们释放。克服这个问题的方法之一是使负载小分子的电荷密度低到预制的胶囊或薄膜。装载机构通常由扩散的方式通过层-层薄膜，分子扩散的结果往往是在第一个48小时内在毛孔内有释放，另一个解决方案是在更大范围内使聚电解质的药物或肽加倍。这个策略有被使用，例如，系绳抗炎十三碳肽，α-黑素细胞刺激素，聚-L-谷氨酸酸和封装中的抗肿瘤的药物，脂质体。这种共轭允许装配稳态大多通过层层技术层。通过层—层组装使小肽直接作为建筑物成分的使用，已经表明有很大的挑战.成功的寡肽直接蒸发在层层的过程中是取决于链的长度和缩氨酸的带电状况。由短肽-L-谷氨酸（分子量为150kDa的）聚-L-赖氨酸（分子量为3.8kDa）形成层的不稳定性支持这一假说。近日，由36个氨基酸组成且带九个正电荷的抗癌多肽和由40个氨基酸组成带五个互动的静电荷残基的小的抗菌肽防御素，已被证明与聚阴离子形成稳定的膜-肽且有线释放期超过7天。同样地，由32个氨基酸组成的多肽被专门设计成任一16个正电荷或负电荷的残基，电荷或负电荷残基已成功地运用层—层技术为积木构造空心胶囊。这些研究包括利用层—层技术多肽薄膜的制作和肽释放的控制代表一个重大的里程碑，同时利用静电和具体的短程相互作用，如面包车范德华力和氢键。人体激素的抗黑色素细胞刺激素（α-MSH）是潜在的层—层组件的合适模型肽，因为它具有典型的许多新发展的药物。1.6kDa的肽有13个氨基酸残基是已知的调节体外和体内模型中的炎症中炎性细胞因子的产生。这种肽大多由疏水性的中性残基组成，与三个电荷的残基随机分布在骨干，谷氨酸，精氨酸，赖氨酸，这样有助于净电荷的生理pH值保持为+1。以前，抗炎黑色素细胞刺激素共轭聚-L-谷氨酸，然后将其用于与相反电荷的聚-L-赖氨酸以创建生物活性涂层与抗炎症的假牙和牙科植物。然而，目前尚不清楚是否可以在没有层—层组装的情况下将促黑色素细胞刺激素纳入。我们先前已经表明，抗黑色素细胞刺激素可直接吸附表面上的可生物降解的聚合物，聚乳酸（PLGA），通过疏水性相互作用。在这个研究中，我们探讨α-MSH在溶液中的结构和PLGA结合后利用光谱技术分子动力学（MD）模拟的目标决定挖掘层层沉积稳定的最佳条件。光谱技术分子动力学曾提供了关于层—层技术的一些方面的见解，包括聚电解质络合他静电间的相互作用，疏水性关系相互作用，氢键的形成和二级结构，所有这一切都最终影响膜的稳定性，初步研究多层构造在一个平面系统和分子动力学用于模拟的疏水的α-MSH的分子排列模型表面，以确定用于离子的层层组装的最佳的配置。优化分层条件被认为是一个三维的结构，在这里多层颗粒将可能允许可调的促黑色素细胞刺激素释放，用来调节由生物材料和组织工程植物造成的炎症。2.材料与方法2.1.石英晶体微天平测量石英晶体微天平（QCM）是用来测量评估生物分子结合到一个2D的羟基乙酸共聚物的膜上。2.1.1.羟基乙酸共聚物膜的制备镀金的5MHZ切石英晶体在二氧杂环己烷中浸泡1分钟后，然后再用混合的纯净水清洗，再与氨和过氧化氢以体积比为5:1:1在75度的条件下反应5分钟，.然后将晶体彻底用纯净水冲洗，最后用乙醇清洗，将结晶侵渍在5mM的1-乙基3-巯基乙醇溶液中12小时，然后用羟基乙酸共聚物旋涂，在1％的二甲基碳的溶液中旋涂羟基乙酸共聚物，然后在3000rpm下结晶2分钟并且在75℃的热板上退火2小时，这便成了羟基乙酸共聚物的膜。为了探讨聚电解质层之间促黑色素细胞刺激素的整合，羟基乙酸共聚物膜晶体首先在室温下浸泡在3％的1,6-己二胺和异丙醇溶液中30分钟。剩下的结晶，用纯化水在0℃下侵泡三次，再进一步在0℃下侵泡1小时，在真空下干燥，存储在硅胶的干燥器中12h，直至进一步用于其他的实验中，羟基乙酸共聚物涂层的晶体是氨基裂解的。然后将处理或未经处理的结晶放置在一个Q感为D300的分析室中。2.1.2.层-层大会上平面曲面这项研究为编写生物分子提供了解决方案。促黑色素细胞刺激素肽肽定制合成了-大小由CS生物与95％纯度的肽和肽的质量通过质谱证实，多肽被溶解在任一用5MNaOH调节的PH为5.5，50μg/ml的浓度为10mM乙磺酸缓冲液中，已得到调整到或10毫米招聘缓冲区中的已调整到pH9的1M盐酸壳聚糖中期的一个分子量CS，粘度为286cP、多编号准备在5毫克/毫升浓缩的0.1M乙酸。壳聚糖及透明质酸都在con-编写中心偏的50μg/mLph值为5.5浓度为10毫米的MES缓冲区中。为了研究脂质吸附在α-MSH涂层的水性缓冲液中。在单层脂质体的制备由类脂溶液在氮气1小时，以产生2.5毫克蒸发氯仿两性离子脂质或带负电荷的2.5毫克的DOPC：DOPS以4:1的比率。干燥脂质然后用1mL的MES或TRIS缓冲液取决于水合对于分层所需的pH值。将每个溶液挤出，通过50nm的外部滤波聚碳酸酯（滤纸，ME）31次获得单分散尺寸的脂质体。由此产生的脂质体然后稀释至1mg/mL的为分层的QCM晶体。一旦基线获得，在任一ph值为9的α-MSH溶液或在10毫米MES黄油在色版10毫米MES黄油用于装配在初始层PLGA涂层表面上。切换图层用于组装在PLGA涂层的表面的初始层。该交换层通过引入两种医管局的组装在10mM的MES缓冲液，pH为5.5或DOPC在10mMTris缓冲液在pH为9或10mM的MES缓冲液中，它的pH为5.5，取决于pH值的α-MSH吸附或DOPC/DOPS10mM的MES系统缓冲液pH为5.5。一旦切换层形成时，多层薄膜，继续在CS交替吸附和HA直至各层的期望数目已经建立。所有的HA用于分层处理的解决方案已经被激活如上面所描述的交联剂。所需的解决方案进行了介绍，并培养在测量范围内室，直到观察到的频率没有进一步的变化，这表明平衡已经达成。样品漂洗，以除去未吸附的生物分子具有相同缓冲区用于加载引进了新的解方案之前，为下layer.Each时间的新缓冲液，一个新的基准建立后，测量被收集在5兆赫，以及所述第三，第五和第七泛音（分别是14.9，24.9，和34.9兆赫）的基频。与在QCM室中的温度保持恒定在23.5℃。材料（M，毫微克/厘米）吸附在PLGA使用erbrey方程(当量1)M=cΔF其中c是常数17.7ng/(cmHz)，ΔF是由于沉积的材料(Hz)频率的变化。2.2.PLGA微球的生产PLGA微球使用油包水乳状液和如先前所描述的溶剂蒸发技（术进行生产。简言之，将10％的（重量/体积）的PLGA溶液的制备在二氯甲烷中，将聚合物溶液乳化在1％（重量/体积）的聚（乙烯醇）水溶液，在1500转用IKARW20顶置式搅拌器与一个径流式涡轮。乳剂搅拌过夜使大部分的DCM蒸发，所得在聚合物沉淀和固体的形成微球体。将所得微球5250g离心5分钟，离心收集并用纯净水洗涤5次。然后大气条件下干燥24小时。2.3傅里叶变换红外显微镜吸收纯化和α-MSH对PLGA的二级结构的微球是通过探测傅立叶变换红外光谱（FTIR）显微镜。加载未改性的PLGA微球安装在EZ-现货微型摩样品幻灯片。FTIR光谱收集在海波在反射率3000焦平面阵列模式为4厘米，128扫描的光谱分辨率使用布鲁克作品6.5软件（布鲁克Optics公司，美国）。数据收集1600厘米和1840厘米之间的酰胺I区域，并且通过使用加权平均滤波的5个数据点。这项研究进行基础设施红显微光束线在澳大利亚同步加速器，澳大利亚维多利亚州。2.4.圆二色性远紫外圆二色性(CD)光谱在一个J815CD光谱仪使用1毫米的路径长度、石英试管。在10mM收集了CD光谱的100μg/mlα-MSH缓冲液ph值为9和10毫米MESph值为5.5的缓冲区中。α-MSH肽的结构也被判断从PLGA表面吸附，解吸。150毫克PLGA微球的示例被孵化与3毫升的250Μg/mLα-MSH溶液10毫米的MES缓冲区在pH92h以促进吸附。一旦被加载，α-MSH被释放到1毫升的纯净水中ph值为7在37摄氏度下72小时。悬浮液在9000g下被离心3分钟。在卷上清含α-MSH减至100μL使用真空离心浓缩仪在45摄氏度下，增加信号强度来记录有意义的频谱。水被选为释放介质，其ph值是生理ph值，盐的存在会导致重大散射后肽释放和缓冲的分光-中心偏前CD光谱。CD谱的新鲜Α-MSH在比较用水也被确定了。所有样本的排烟是保持恒定在23摄氏度。在裁谈会期间使用循环水浴测量。光谱收集在185和260nm处，之间以0.1nm的间隔和扫描速率为50纳米/分钟。每个光谱扫描的平均值是6。进行CD光谱的反卷积，使用CDSSTR算法和DICHROWEB在线服务器。2.5.分子动力学模拟α-的模拟MSH（与乙酰化N-末端和酰胺化C端）的溶液中的肽放置在一个长方形的模拟箱40A的，溶剂化与2100点的简单构造费用（SPC）的水分子。对于模拟〜pH值为9或5.5，1或2个氯离子分别被列入溶剂，以以确保整体电中性。为了模拟在两个pH值值，α-MSH建模与电荷的碱性和酸性侧链。在pH值为9，在他的侧链质子化只在Nε位置（中性残基），而在pH为5.5时双方的Nε及Nδ仓质子（+1电荷残基）。对于这两种pH值为9和5.5，六个独立的模被执行的，与不同的起始肽的构象。这些包括一个全延伸链（图S1A的证明资料），一理想的α-螺旋（图S1C），两个紧凑型无规卷曲（图S1D，E）和两个扩展无规卷曲（图S1F，G）。该后四种结构分别通过使用前奏曲获得和神游服务器来预测α-MSH构象和对应到4的低能量结构，例如用得分确定函数的方法。为了研究