细胞免疫荧光技术

细胞免疫荧光技术实验目的掌握免疫荧光技术的基本原理熟悉细胞免疫荧光技术的方法了解在免疫细胞化学技术中如何获得好的实验结果实验原理原位检测抗原抗体特异反应间接法间接荧光抗体染色法示意图抗原抗体荧光素标记的抗抗体激发光显示荧光Hela细胞Vinculin实验用品试剂：固定液：4%PFA细胞通透：0.2%TritonX封闭试剂：10%正常山羊血清一抗：小鼠源抗Vinculin单克隆抗体二抗:AlexaFluor555标记的山羊抗小鼠IgGDAPI（4’,6-二脒基-2-苯基吲哚）PBS洗涤缓冲液：PH7.4材料：Hela细胞细胞培养皿仪器：荧光显微镜实验步骤一，细胞制备和细胞固定将细胞铺在24孔板中将细胞培养至所需密度加入4%PFA固定10min染色或保存PBS洗涤PBS洗涤实验步骤二，细胞免疫荧光ICC染色0.2%TritonX处理5min封闭室温30min4℃过夜37℃1-2小时37℃5-10min荧光显微镜观察加入一抗加入二抗加入DAPI复染PBS洗涤PBS洗涤PBS洗涤实验结果三，观察humanHeLacells实验中应注意的问题细胞不要铺的过密:60-70%防止细胞污染固定时间不要太长,一般10-30minTrionX处理时间不宜过长，膜蛋白可不必处理选择合适的封闭液二抗孵育后,一定要洗干净必要时用恒温摇床摇洗1.免疫荧光技术2.免疫酶技术3.免疫亲和技术4.胶体金技术标记物使抗体或抗原抗体复合物在各种显微镜下可见的物质免疫细胞化学技术免疫细胞化学技术注意事项选择合适的方法材料要留好选择抗体选择标记酶封闭液的选择设定对照实验思考题检测Hela细胞中蛋白A定位情况，思考应选择什么方法，用什么仪器观察？A疑难解答一，缺乏染色可能的原因无抗原抗体失效固定不充分过度固定抗原修复无效不兼容的二抗和一抗漏用试剂或未按正确的顺序加入试剂相应的措施用原位杂交方法检测蛋白表达按说明书储存抗体;分装抗体;避免反复冻融增加固定时间或改用不同的固定剂减少固定时间;抗原修复增加修复时间或更换修复液使用可以与一抗结合的二抗重复染色并确定使用的试剂和加入的顺序二，高背景可能的原因一抗或二抗的浓度过高一抗和/或二抗与组织的非特异性结合组织过于干燥试剂粘附在旧的或未制备好的玻片上相应的措施预实验摸索最佳浓度一抗孵育前封闭(最好是二抗来源的血清)在染色过程中避免组织干燥用新鲜制备或购买的玻片进行实验三，细胞/组织的形态被破坏可能的原因抗原修复方法过于剧烈组织切片从玻片上脱落组织切片撕裂或褶皱,切片下有气泡组织形态难以分辨组织固定不充分,自发裂解相应的措施预实验摸索合适的修复条件增加固定时间;烤片;使用新鲜准备的带有充足电荷的玻片使用锋利的刀片;分析时避开受损的区域切片薄一些;冰冻过程形成冰晶,蔗糖脱水及时固定;增加固定时间;提高固定剂/组织的比例;将组织切得较小四，染色不正确可能的原因固定方法对于抗原不合适抗原修复方法不合适没有及时固定引起抗原的扩散相应的措施尝试不同的固定剂或增加固定时间尝试改变抗原修复条件立即固定组织;尝试用交联性固定剂替换有机(醇类)固定剂