毛细管电泳

第20章毛细管电泳法(CapillaryElectrophoresisCE)•概述•20.1CE的基本原理•20.2CE的分离模式•20.3毛细管电泳仪•20.4CE在医药中的应用进展概述电泳：溶液中的带电粒子（离子、胶粒或分子）在电场中的定向迁移现象。物理化学现象。•毛细管电泳（又称高效毛细管电泳）（HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型电泳分离技术。•包含电泳、色谱及其交叉内容。电泳法（electrophoresis）以电泳为基础的分离分析方法。•电泳法的发展史(Phylogeny)：•电泳现象早在18世纪就被发现。•1909年，L.Michaelis提出“电泳(electrophoresis)”这一术语，他的实验是用于测定蛋白质的等电点。•1937年，瑞典科学家A.Tiselius成功研制出界面电泳仪，并建立了移动界面电泳法，用于人血清蛋白的分离。•Tiselius于48年获诺贝尔化学奖。•花絮•1937年，Tiselius(瑞典)将蛋白质混合液放在两段缓冲溶液之间，两端施以电压进行自由溶液电泳，第一次将人血清提取的蛋白质混合液分离出白蛋白和α、β、γ球蛋白；•发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；•第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；•1948年，获诺贝尔化学奖；1.经典电泳技术利用电泳现象对某些化学或生物物质进行分离分析的方法和技术叫电泳法或电泳技术。•经典电泳法自由界面电泳（无载体电泳）区带电泳（有载体支持电泳）•界面电泳：在没有惰性支持物的液体接界面上进行的电泳。缺点：对流较严重，组分不能完全分离，检测困难•区带电泳：是在溶液中加入一些惰性物质或凝胶物质作为支持物，泳动物质在支持物间隙中移动的电泳方法。避免对流的干扰。纸电泳醋酸纤维素电泳淀粉凝胶电泳琼脂糖电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳•常压电泳：电位梯度50V/cm•高压电泳：电位梯度50V/cm影响因素：1.电荷效应2.溶液pH值3.离子强度和温度4.电渗5.载体性质和分子筛Eu电泳速度电场强度V/L(V/m)电泳速率传统电泳的缺陷：（1）焦耳热效应：电流通过电泳介质而产生的热效应。使电泳分离介质温度分布不均匀，引起溶液对流，从而导致区带展宽，降低分离效率。焦耳热效应随电场强度的增大而迅速加剧，限制了高电压的使用。（2）无法在线检测，定量精度较差。2.高效毛细管电泳技术1981年，Jorgenson和Luckas，用75m内径的石英毛细管电泳分离了丹酰化氨基酸，柱效高达40万/m，使电泳技术发生了根本变革，迅速发展成为可与GC、HPLC相媲美的崭新的分离分析技术——高效毛细管电泳。毛细管电泳：使电泳过程在散热效率极高的毛细管内进行，使焦耳热效应减小，能使用高电压，全面改善分离质量和提高分析速度。总之，与经典电泳法比较，毛细管电泳法的特点有四个：高效、快速、微量和自动化。毛细管的使用使产生的热量能够较快散发，大大减小了温度效应，可以使用很高的电压。电压升高，电场推动力大，又可进一步使柱内径变小，柱长增加，理论塔板数高达几十万块/米，特殊柱子可以达到数百万。高效毛细管电泳在技术上采取了三项重要改进：一、采用了50m内径的毛细管；二、采用了高达数千伏的高电压；三、实现了高灵敏度的在线检测。•1981年，Jorgenson．和Lukacs使用75μm内径的熔融石英毛细管，电泳分离氨基酸和肽，成为高效毛细管电泳划时代的里程碑。至此，出现了毛细管电泳技术。•80年代以来，诞生了很多新的毛细管电泳方法，如毛细管凝胶电泳和毛细管等电聚焦电泳。•88年商品化HPCE问世，高灵敏度柱上检测器的发展使HPCE在世界范围内蓬勃开展。HPCE已成为电泳领域发展最快的新分支。毛细管电泳的发展高效毛细管电泳法与高效液相色谱法比较（1）分离过程：相同HPCE与HPLC都是一种液相分离分析技术。都是差速迁移过程，可用相同的理论来描述,如保留值、塔板理论和速率理论等。（2）分离原理：不同（驱动力不同）HPCE：带电粒子在电场中发生定向移动，依据粒子所带电荷数、形状、离解度等不同所产生的差速迁移而分离。HPLC：不同组分在两相中的分配系数不同而分离。（4）应用：二者相互补充HPCE在生物大分子分离方面，在分析速度和效率、样品和试剂用量方面有优势，但在样品制备和定性、定量重复性等方面不及HPLC。（3）仪器流程：基本相同都包括进样装置、分离柱、检测器和数据记录处理等部分。1.分离模式多：2.分析速度快、分离效率高在3.1min内分离36种无机及有机阴离子，4.1min内分离了24种阳离子；分离柱效：105～107/m理论塔板数；3.操作方便、消耗少进样量极少（纳升），水介质中进行；4.仪器简单、易自动化电源、毛细管、检测器、溶液瓶5.应用范围极广有机物、无机物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物学、医学、药学、化学、环境保护、材料等；小结：高效毛细管电泳法的特点（多、快、好、省）20.1毛细管电泳的基本原理一、电泳和电泳淌度二、电渗和电渗率三、表观淌度四、分离效率和谱带展宽五、分离度Euepep4iep－介质的介电常数－介质的粘度i－粒子的Zeta电势,近似正比于Z/M2/3Z为净电荷，M为摩尔质量。电泳的速度uep可表示为：•ep—电泳淌度，单位电场下的电泳速度。空心毛细管柱中一个粒子的淌度近似表示为：一、电泳和电泳淌度与介质性质有关与粒子性质有关：表面电荷和粒子质量的大小epefiii有效淌度：在实际溶液中，考虑离子活度系数、溶质分子的离解程度均对粒子的淌度有影响，这时的淌度称为有效淌度。i—样品分子的第i级电离度i—活度系数或其它平衡离解度总之，粒子的迁移速度除与电场强度和介质的特性有关外，还与粒子的离解度、电荷数及其大小和形状有关。不同的带电粒子电泳速度不同，可以实现分离二、电渗和电渗率•电渗（electroosmotic）：在电场作用下，液体相对带电的固体支持介质移动的现象，又称电渗（流）EOF。石英毛细管表面含有许多硅醇基（Si—OH），在一定的条件下可离解使表面带有负电荷。毛细管中的电渗流的形成双电层抗衡离子•机理：当在毛细管两端加有电场时，双电层内靠近管壁的稠密层中可迁移阳离子向阴极移动。由于离子是被水化的，因此，带动管中的液体也随迁移着一起匀速向阴极移动，形成电渗流。总之，毛细管中的电渗流是毛细管内壁表面电荷所引起的管内液体的整体流动。电渗流的特点：具有一定流型，其电渗驱动力沿毛细管均匀分布，所以电渗速度的径向分布几乎是均匀的。•eo—电渗率，单位电场下的电渗流的线速度ososEuosos－介质的介电常数－介质的粘度－管壁的Zeta电势，即双电层到管壁很近的地方之间的电位差。总之，Zeta电势越大，介电常数越大，粘度越小，电渗流越大。在电场作用下，电泳和电渗同时存在，电渗流速度是电泳的57倍。电渗的速度可以表示为：硅醇基阴离子石英毛细管柱内壁的双电层结构图双电层电势表面电势0Stern电势d电动电势双电层模型•电渗流的控制：•电渗流是毛细管电泳的基本操作要素，为了优化分离，有必要对它进行控制。•电渗流的控制要求对毛细管表面及缓冲液的粘度进行调节。•（1）电场强度•（2）缓冲溶液的pH（影响管壁带电情况）•（3）缓冲溶液的浓度和离子强度（影响Zeta电势）三、表观淌度•在毛细管电泳中同时存在电泳流和电渗流，所以带电粒子在电场中的迁移速度由两者同时决定，可表示为：Euuu)(osefosefaposefap•uap—表观迁移速度•ap—表观淌度注：一般情况下，uosuefefosapuuuefosapuuuosapuu中性分子阳离子阴离子电渗流四、分离效率和谱带展宽1.柱效参数－理论塔板数和塔板高度2)/(54.52/1WtnmnLHd/理论塔板数：塔板高度：Ld——进样口到检测器之间的距离tm—迁移时间，W1/2—时间半峰宽uDH/2DELDuLndapd2/2/影响柱效的因素：（1）n与E成正比，E越大，柱效越高。（2）n与溶质的扩散系数（D）成反比，D越小的分子柱效越高。毛细管电泳的速率方程：理论塔板数：溶质的扩散系数只有纵向扩散项2.引起带展宽的因素电渗的流型：呈塞状扁平流型扁平流型是毛细管电泳获得高分离度的重要原因之一，是理想状态。（1）扩散uDH/2扩散系数由溶质本身的性质决定，随分子量的增加而降低。分子越大，D越小。因此，毛细管电泳特别适合分离生物大分子。另外，凡是能影响溶质扩散的因素都会影响谱带宽度。（2）自热（焦耳热）•焦耳热通过毛细管壁向周围环境散逸时，在毛细管内形成径向温度梯度（管壁温度管轴心温度）表：毛细管壁温度和中心到壁的温差半径（m）壁温度（K）温差（K）25299.00.5350301.21.3975304.23.14100307.75.58125311.68.72•径向温度梯度导致缓冲溶液的径向粘度梯度，引起电泳淌度改变，导致离子迁移速度的径向不均匀分布，破坏了区带的扁平流轮廓，导致区带展宽，柱效降低。•焦耳热和温度梯度的控制•焦耳热的大小与毛细管尺寸、缓冲液电导及电场强度有关。•操作电压：电压越高，焦耳热越严重。•柱内径：是影响焦耳热的一个重要因素。内径越小，焦耳热的影响越小。通常毛细管电泳采用尽可能小的柱内径。•缓冲溶液的浓度：浓度增加，焦耳热增加。•目前常采用内径为25～75m的毛细管柱•采用外管壁涂层技术。Knox方程：Edc1/3＜1500E—电场强度，d—管内径，c—介质浓度满足上式方程，自热影响较小。当E=50kV/m,c=0.01mol/L时，d＜140m即能满足上述方程。(3)吸附•毛细管电泳中的吸附作用主要指毛细管管壁对被分离物质粒子的作用。•主要原因：•阳离子溶质和带负电的管壁离子相互作用；疏水作用。•吸附作用与毛细管表面积与体积之比有关。•内径越细，吸附越严重。五、分离度•分离度：将淌度相近的组分分开的能力。uunR4n—理论塔板数Δu/u—两组分的相对迁移速度差4)(2122112mmmmttWWttR定义式：根据Gidding方程，分辨率R定义为：对上面的公式处理，可得：2/1))()()(241(eodDLVLR由公式可见：R并非随操作电压线性增加，而是与操作电压的平方根成正比。操作电压的增加受到焦耳热的限制。20.2毛细管电泳的分离模式一、毛细管电泳的分类二、毛细管区带电泳法三、胶束电动毛细管色谱四、凝胶毛细管电泳法五、毛细管电色谱法一、毛细管电泳的分类按分离模式可分为三大类电泳型毛细管区带电泳毛细管凝胶电泳毛细管等电聚焦电泳色谱型毛细管电色谱胶束电动毛细管色谱微乳液电动毛细管色谱电泳/色谱型√√二、毛细管区带电泳法（CapillaryZoneElectrophorsis,CZE）•毛细管区带电泳（又称毛细管自由溶液区带电泳法）是毛细管电泳中最简单、最基本、使用最广泛的一种技术。•CZE的理论是其它CE方法的理论模板。efosapuuuefosapuuuosapuu中性分子阳离子阴离子1.分离机理在只填充缓冲溶液的毛细管中，不同质荷比大小的组分在电场的作用下因淌度不同而进行分离。在毛细管中，由于电渗流的存在，所有溶质都随电渗流一起向负极迁移。在CZE中可以实现正负离子（或粒子）的同时分离,中性粒子随电渗流一起流出毛细管,不能分离（图谱上是一个峰）。组分的检出顺序为：阳离子（粒子）＞中性粒子＞负离子（粒子）CZE溶质的迁移规律小结：•2.影响CZE迁移速率的因素（操作条件的选择）（1）操作电压操作电压与毛细管的内径和长度及缓冲溶液浓度（离子强度）有关。•柱长一定时，在一定电压范围内，操作电压与粒子的迁移速度呈线性关系。•当电压过高时，线性关系偏移，主要是由高电压引起的焦耳热造成的。电压的极值范围随系统和组成而异。一般为小于30KV。•电压对柱效的影响也是相同的。（2）缓冲溶液的选择：重要的