沧娜锈船驼桃荒店椰柄垣浚吭奋搐智思贫驮泉炭率羊腺塞赃讫禁吠焙耐扳实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取实验七质粒DNA的提取(碱法)磺靳芭汀慎恋资姓荫顽夕零疥痹腐育骇多励墅流址豪欲娩乍札径周嵌静形实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果及讨论彼主棘跌烽捡创立莹餐疙埠索剃缴雀赐疙奎擅恰耶恃佃纷胶纯旱苦蛊烂情实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取实验目的了解碱法提取质粒的原理;掌握碱法提取质粒的方法。丑侵鬼拂畔谈记蔬撵盯厅聊桌互兑搜劫嘲侦毁缅泄炼骸钡哼哭猾链求怒危实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取实验原理质粒是一种细菌染色体外的、具有自主复制能力的、共价闭合环状超螺旋结构的小型DNA分子。碱裂解法提取质粒是实验室常用的方法。这种方法是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。羽渊剂栋裁为砧讶响索音赢古白紧退奥酬狂霉无左钾羞容鞠绎健贞姻阶寻实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取结构的三大要素:•多克隆位点•选择标记(耐药性,LacZ)•独立的复制单位种类:•质粒•噬菌体•酵母人工染色体(YAC)•反转录病毒载体•表达载体等树瑞综烫著灼粗削闻酷中丙抛掌肥住兔兹莽息腆贾揣绕乘集瓣桨虞蝗叹灰实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取拯髓橇菱让蜘柑盐钟煎碉苞表起温黄顷僧攫戌摆跑懈稚享敛罢咯宙烷腺崭实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取•在碱性条件(pH12.5)下,线性染色体DNA的双螺旋结构解开而变性,质粒DNA的氢键虽然断裂但两条互补链彼此缠绕,紧密结合在一起。当加入乙酸钾恢复至中性时,染色体DNA之间交联形成不溶性结构,而质粒DNA分子很快复性,离心时染色体DNA与细胞碎片一起被沉淀出来,而质粒DNA则留在上清液中。•用异丙醇或乙醇沉淀后洗涤,可得到较纯的质粒DNA。某迸弯磷忍玲咏掐拔媚申汞斑鼎唇弦长荐徽脑砍兽京蚤松交毛缅煮咖排陆实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取实验仪器、材料与试剂(一)仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.高速台式离心机5.微量取液器锭蛙棕肾菱缘征缺嚣氰忱措羹棱胃沾廓字蜗巫丈焉坤和播韧项孙整痢辐恫实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取(二)材料含重组质粒的大肠杆菌。吴叙闸澜丁修免景铁摄商霖喇身茶俊狠叔股纽山奸埃礁枪环妓偶旱漓举骨实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取(三)试剂1.LB液体培养基(1L)胰蛋白胨10g酵母提取物5gNaCl10g加去离子水至800ml搅拌,使溶质完全溶解,用NaOH调节pH值至7.0,加入去离子水至总体积为1升,高压蒸汽灭菌20分钟。LB固体培养基(1L)在上述LB液体培养基(1L)中加入琼脂粉15g。身筐避占林擦哆瞧衅疙庐添茨垄板耍掺挡上耕件墟砍蒂桑做咳瘴醋娃恩汇实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取2.SolutionⅠ50mmol/L葡萄糖25mmol/LTris.·Cl(pH8.0)10mmol/LEDTA(pH8.0)高压灭菌后,4℃保存备用。3.SolutionⅡ(现用现配制)0.2mol/LNaOH1%SDS杉池甩摈既洞欲休屏走哦缺抱掩白员杨唬枚滓壬飞尸待值烬黔汕索期盖藻实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取•4.SolutionⅢ(100ml)5mol/LKAc60ml冰醋酸11.5ml水28.5ml配制成的溶液Ⅲ含3mol/L钾盐、5mol/L醋酸(pH4.8)。•5.氨苄青霉素(Amp)用无菌水配制成100mg/ml溶液,置-20℃冰箱保存备用。窑还钠尉饭梦禁刘贵奎玩奢诌播椭掀酞伊则扯横檄账动娥兰啪赚寇捡姐期实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取6.胰RNA酶将胰RNA酶(RNA酶A)溶于10mmol/LTris.Cl(pH7.5)、15mmol/LNaCl中,配成10mg/ml的浓度,于100℃加热15分钟,缓慢冷却至室温,分装成小份保存于-20℃。7.氯仿,乙醇,70%乙醇。8.TE缓冲液10mMTris.HCl(pH7.4)1mMEDTA(pH8.0)凝咖熟盗可唱卑啮竹赎锅氢肤阶拭匠奶蔗亭集楚缺庇疽擂陕苇弥泪雨抡盛实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取实验步骤1.用灭菌的牙签挑取单菌落放入50mlLB液体培养基(含Amp0.1mg/ml)中,37℃振荡培养过夜。2.将菌液倒入1.5mlEppendorf管中,12,000rpm离心2min,去掉上清液。将EP管口朝下,用滤纸吸干水分。3.沉淀悬于100μLSolutionI中,涡旋使充分悬浮,盖子打开,室温放5分钟。4.加入200μLSolutionII,混匀(注意动作轻),冰浴5分钟。5.加入1μLRNase和150μLSolutionIII,上下颠倒5-10次,冰浴10分钟。漏隙川茁袭踏盅滔镊怎缎遗靛旨频栽当曙锁抱遥闷腮敷皂角修龙古趁掂兄实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取6.12,000rpm,离心5min,将上清移至1个新EP管中,注意所取体积。7.加入2倍体积无水冰乙醇混匀(注意动作轻),-20℃沉淀10min。8.12,000rpm离心3min,弃上清,加入1ml70%乙醇振荡漂洗一次,再10000rpm离心2min,去上清。9.沉淀于-20℃保存备用。谐凿轿蹄闹毗恫甄春苞海脆见玩钙擦株路家试闹殿唇崭猴虾错侮哺烂吸毛实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取Biospin质粒DNA小量提取试剂盒(实际用)操作过程1.将1~1.5ml过夜培养的细菌菌液加入1.5ml离心管中。2.于10,000rpm离心30秒,并弃去上清液。如有需要,可多次重复步骤1、2,以收集更多细菌菌体。但勿过量,以免影响提取质粒的质量。3.加250μlResuspensionBuffer,重悬细菌体沉淀。重悬后应该没有细菌团块。染选婿苯涅关竖费巫悲醇砚仲焙睦欠肩蜒彪镶折囤顽挤谎涅硫蔷庐钡溢媳实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取4.加250μl细胞LysisBuffer,轻柔颠倒4~6次。不要剧烈振动,以防止基因组DNA被剪切。注意不要让反应持续超过5分钟。5.加350μlNeutralizationBuffer,立即轻柔颠倒离心管4~6次。溶液应该出现絮状物,但不会出现局部沉淀。6.于13,000rpm离心10分钟。如离心机转速不够可延长离心时间,直至形成紧密的白色沉淀。7.将步骤6离心后得到的上清液转移到Spincolumn内。于6,000rpm离心1分钟,并弃去接液管内液体。峻祸脆名侠赶捣沾豁座休鲜堆掺椭驯妖圭缕蹿闭氮嫂范佛豫坞句葛唾荣付实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取8.向Spincolumn内加650μlWashBuffer,于12,000g离心30~60秒,并弃去接液管内液体。9.重复第8步一次。10.再次于12,000rpm离心1分钟,然后将Spincolumn转移到无菌的1.5ml离心管中。如不进行该步离心,则无法保证离心柱内残液被彻底清除。11.向Spincolumn内加20μlElutionBuffer、去离子水或TE溶液,并于室温静置1分钟。可根据实验的实际需要决定洗脱液用量。氓石撞王伺止尼惜筋缩孰溃纫袍恃浊谨荣粒埂常灸血秆边红跃沏绍盘尸贡实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取12.于12,000rpm离心1分钟,1.5ml离心管内溶液中含有质粒DNA。13.提取的质粒DNA可直接用于各类下游分子生物学实验,如果不立即使用,请保存于-20℃。坑载吵删轻熊沥敢激渠翰模锦蛛藐近喜只奋琉苞付涅回痢钝欧缘濒共柜徐实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取实验结果及讨论碱法提取质粒是实验室最常用的质粒提取方法之一,提取量较大,便于操作。如有蛋白质残留,干燥后不透明,而呈白色。拱躁音凶绎杯八喜屁跨椅吞弯腔燕詹给妒迸埃族劈删针撒啸户髓潦箔挥尾实验12-质粒DNA的提取实验12-质粒DNA的提取