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微生物(microorganism)结构简单、形体微小的单细胞、多细胞或没有细胞结构的低等生物。例：酵母、霉菌、细菌、放线菌、病毒和小型原生动物等等微生物的利用：抗生素；酒；腐乳；污水治理……历史小资料19世纪中期，关系到法国经济命脉的酿造业曾一度遭受毁灭性的打击。在生产过程中，出现了葡萄酒变酸、变味的怪事。经过一番研究，法国科学家巴斯德发现，导致生产失败的根源在于发酵物中混入了杂菌。保持培养物纯净，保证无杂菌污染很重要！大肠杆菌的培养与分离一、大肠杆菌（E.coli）兼性厌氧的肠道内的共生菌群合成维生素B和维生素K，供机体利用；产生大肠杆菌素，抑制肠道致病菌和腐生菌滋生。革兰氏阴性菌作为一种工程菌，在基因工程技术中被广泛采用。例：大规模生产治疗糖尿病的药物——胰岛素培养基（culturemedia）按照微生物对营养物质的不同需求，配制出的供其生长繁殖的营养基质。提供微生物生长的条件：合适的温度：25-37℃合适的pH：细菌6.5-7.5中性偏碱真菌5.0-6.0中性偏酸营养成分：含有碳源、氮源、生长因子、水和无机盐。LB培养基的配方培养基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至50ml固体培养基的配制：每50ml液体培养基添加1g琼脂琼脂？红藻中提取的多糖,在98℃以上熔化，44℃以下凝固，常温下凝结成有弹性的凝胶。凝固剂培养基种类培养基（培养液）是由人工方法配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养液。（1）按物理状态分：固体培养基和液体培养基、半固体培养基。（2）按功能分：选择培养基和鉴别培养基。（3）按成分分：天然培养基和合成培养基。1.培养基的类型固体培养基：菌落液体培养基：表面生长均匀混浊生长沉淀生长半固体培养基：无动力有动力(弥散)4.培养基的用途液体培养基：增菌、工业生产固体培养基：纯化（分离），鉴定、活菌计数、保藏菌种半固体培养基：动力检测培养基的分类液体培养基半固体培养基固体培养基选择培养基（抑制不需要的微生物生长）酵母菌、霉菌——青霉素金黄色葡萄球菌——高浓度食盐鉴别培养基大肠杆菌——伊红-美蓝培养基物理性质培养基用途一、无菌技术1.无菌技术的概念无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。1）无菌操作：各种器皿必需是无菌的各种培养基必需是无菌的接种时不能带入其他杂菌（１）消毒：指使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体表面或内部一部分对人体有害的微生物。（不包括芽孢和孢子）2.消毒与灭菌的概念及两者的区别（2）灭菌：以物理或化学方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体，芽孢等，而达到完全无菌的过程。有些细菌在一定的条件下，细胞里面形成一个椭圆形的休眠体，叫做芽孢。芽孢的壁很厚，对干旱、低温、高温等恶劣的环境有很强的抵抗力。(3)消毒的方法1、100℃煮沸5-6min2、巴氏消毒法:70-75℃下煮30min或80℃下煮15min。适用于如牛奶、啤酒、果酒、酱油等不宜进行高温灭菌的液体3、用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒4、氯气消毒水源5、紫外线消毒：如接种室空气……(4)常用灭菌的方法：1、灼烧灭菌2、干热灭菌：160-170℃下加热1-2h。3、高压蒸汽灭菌：100kPa、121℃下维持15-30min.4、不能加热灭菌的化合物，如尿素（加热会分解）：G6玻璃砂漏斗过滤（G6孔径最小，细菌不能滤过）1.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果需要，请选择合适的方法。（1）培养细菌用的培养基与培养皿（2）玻棒、试管、烧瓶和吸管（3）实验操作者的双手答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。无菌技术操作要点1、实验操作空间,操作者的衣着和手——2、微生物培养的器皿用具和培养基等——3、为避免周围环境中的微生物的污染，实验操作应在进行。4、实验操作时，应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品相接触。……清洁和消毒灭菌酒精灯火焰附近微生物实验室培养的基本操作程序培养基配制器具和培养基灭菌倒平板微生物接种（斜面→液体）恒温箱中培养分离纯化（液体→平板划线）培养，菌种的保存（斜面）准备阶段培养阶段准备阶段LB培养基（用于培养细菌）1．称量2．溶化3．调pH：pH7．64．过滤：这一步可以省去。5．分装：分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装三角烧瓶的量以不超过三角烧瓶容积的一半为宜。6．加塞、加封口膜7．包扎8．灭菌9．倒平板10．无菌检查：将灭菌的培养基放入37℃的温室中培养24—48小时，以检查灭菌是否彻底。称量蛋白胨酵母提取物NaCl液体LB培养基的配方培养基成分各成分的量蛋白胨0.5g酵母提取物0.25gNaCl0.5gH2O加至50ml固体LB培养基每100ml液体LB培养基中加入2g琼脂，摇匀，灭菌。灭菌培养皿壁上不能沾有培养皿，否则容易污染。1.培养基灭菌后，需要冷却到50℃左右时，才能用来倒平板。你用什么办法来估计培养基的温度？答：可以用手触摸盛有培养基的锥形瓶，感觉锥形瓶的温度下降到刚刚不烫手时，就可以进行倒平板了。2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？答：通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培养基。3.进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？答：恒温培养时，培养基的水分会以水蒸气的形式蒸发，倒放培养皿会是水蒸气凝结成水滴留在盖上；如果正放培养皿，则水分形成的水滴回落到培养基的表面并且散开。如果培养皿已形成菌落，则菌落中的菌会随水扩散，菌落相互影响，很难再分成单菌落，达不到分离的目的。因此，恒温培养时，培养皿必须倒置。小结1什么是微生物？有哪些应用？2培养基的基本营养成分及其配制方法3无菌技术：消毒和灭菌（高压蒸汽灭菌法）4微生物培养的基本程序（倒平板技术）微生物在自然界中呈混杂状态存在，要获得所需菌种，必须从中进行分离。在保藏菌种时不慎污染时也需予以分离。怎样纯化分离我们需要的大肠杆菌呢？怎样确保大规模培养繁殖起来的细菌是一个纯种群体呢？菌落：单个细菌细胞在固体培养基上培养10--20小时后，会繁殖成许多个细菌细胞。这些细胞紧紧聚集在一起，形成菌落。每一个细菌产生一个菌落。将待分离样品进行一定的稀释，并使微生物的细胞尽量以分散状态存在，然后使其长成一个个纯种单菌落。大肠肝菌的分离微生物的接种技术：将一种微生物移接到另一灭菌培养基上的过程。例如：将液体培养基中的大肠杆菌接种到固体培养基上，以便于进行分离。微生物的分离技术：涂布分离法划线分离法划线分离法一旦划破，会造成划线不均匀，难以达到分离单菌落的目的；二是存留在划破处的单个细胞无法形成规矩的菌落，菌落会沿着划破处生长，会形成一个条状的菌落。1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？答：以免接种环温度太高，杀死菌种。3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。涂布分离法涂布分离法涂布分离法3.进行恒温培养时，为什么要将平板倒置？答：恒温培养时，培养基中的水分会以水蒸气的形式蒸发，如果正放培养皿，则水分形成的水滴会落如培养基表面且扩散开。若培养基中一行成菌落，则菌落中的菌会随水扩散开，菌落间相互影响，很难再分离成单菌落，答不到分离目的。因此，倒置培养皿可以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。菌种的保存1、临时保藏：接种到固体斜面培养基，菌落长成后置于4℃冰箱保存。2、长期保存：甘油冷冻管藏法