MALDI-TOF-MS技术及应用

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）技术2002年诺贝尔化学奖发展了对生物大分子进行鉴定和结构分析的方法，建立了软解析电离法对生物大分子进行质谱分析田中耕一【日】约翰·贝内特·芬恩【美】MALDI技术离子化技术：MALDIMatrix-AssistedLaserDesorption/IonizationMALDI技术的原理样品与基质，在样品靶表面形成的共结晶薄膜激光照射，基质吸收能量基质把能量传递给样品分子，将电荷转移给样品，样品电离。质谱分析原理进样系统离子源质量分析器检测器1.气体扩散2.直接进样3.色谱1.电子轰击2.化学电离3.场致电离4.激光1.单聚焦2.双聚焦3.飞行时间4.四极杆基质辅助激光解吸电离(MALDI)基本原理：将样品分散在基质分子中并形成共结晶后直接进样,当用激光(337nm的氮激光或355nm的固体激光器)照射晶体时,基质吸收了激光的大部分能量，使基质分子和样品获得能量投射到气相并得到电离，成为带电荷的离子。因此基质在样品离子形成过程中起到了质子化或去质子化的作用，使样品分子带上正电荷或负电荷，成为带电荷的离子。离子源特点:1、使用脉冲式激光；2、产生单电荷离子和部分双单电荷离子，质谱图中的谱峰与样品各组分的质量数有一一对应关系；3、离子化效率高，灵敏度高(fmol～amol)常用基质：芥子酸(3,5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)（SA)、龙胆酸(2,5-二羟基苯甲酸)(DHB)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)、吡啶甲酸(PA)、3-羟基吡啶甲酸(3HPA)。MALDI技术中基质的作用把样品分子彼此分开(基质：样品=10，000：1)，削弱样品分子之间的相互作用。基质吸收激光的能量，并将部分能量传递给样品。帮助样品离子化。基质是如何帮助样品分子电离的？以正离子模式为例：•基质吸收激光的紫外波长后增加能量，並将能量部分释放给样品分子•帮助样品分子质子化，並帶有电荷（M+H+）•[M+H]+在真空状态下，雾化形成气态单一分子。在高压电场的吸引下[M+H]+离开离子源飞向飞行管Matrix-CHCA常用基质及选择基质样品HCCA蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物DHB蛋白，多肽，糖，小分子，极性聚合物HPA核苷酸Dithranol非极性聚合物IAA非极性聚合物E=U·z=1/2mv2和t=L/VE：离子在加速电场获得的动能;U：加速电场电压z：离子所带电荷;m：离子质量v：离子飞行速度;L：飞行管道长度t：离子飞行时间;c：常数质量分析范围：500Da---100KDaMALDI-TOF质谱的原理t=c·m/zPulsedlaser3.多肽离子在TOF管里飞行，飞行速度取决于多肽离子的M/Z的大小Flighttube1：基质与多肽样本共同置于刚靶上。HighvacuumTimeHighvoltage2.样本被激光电离形成多肽离子混合物。20-25kV5.检测到每个离子的M/Z后，同一张图谱上计算机输出每个肽段M/Z，即蛋白质的多肽图谱，通过与理论数据库中的肽图片比对，从而鉴定蛋白。4.到达检测器的离子，通过检测器检测出每个肽段离子的M/Z.1.3MALDI-TOF-MS质谱的分析步骤MALDI-TOF-MS线性模式检测SampleplateAnalytemoleculesinmatrixAccelerationgridsDrifttubeIondetectorMassspectrumVacuumsystemVacuumlock几秒钟即可得到结果MALDI-TOF质谱的特点•软电离质谱－碎片少•检测质量范围宽400kDa•灵敏度高－fmol•分析速度快－自动化•数据容易解释•可以测试混合物•可以测试高分子•仪器容易使用、维护triggerdiodelaservariableattenuator250l/sturbo250l/sturbo1.8mlinearMALDITOFMS的构成检测器1：线性模式检测器2：反射模式线性模式和反射模式反射模式（linear）1.一般测试分子量小于4000的样品2.分辨率高，单同位素清晰准确线性模式（reflection）1.一般测试大分子量样品（M4000）2.分辨率低，得到是平均分子量的质荷比反射模式下TOF的分辨率高于线性模式Bruker公司仪器示意图ABI公司仪器示意图岛津公司仪器示意图DetectorHeliumcollisioncellforfragmentgenerationIongateforparentionselectionPulsedLasergeneratesMALDIions20KeVMALDIIonSourceMALDI-TOF质谱的应用应用MALDI-TOF-MS技术鉴定和分类微生物待检样品克隆选择样品制备质谱分析数据分析菌种鉴定?BacillusglobigiiProfilingresultsfromdifferentBacillusstrains-6000-4000-20000200040006000a.i.B.globigiiB.licheniformisB.subtilisB.thuringiensis实验流程ResultReport|DetectedSpecies|Ranking|actSc|maxSc|RelScore|PNk|PNb|PNm|RelP-Num.|I-Corr.|1000*Pro---------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------Spectrum#12|Ps.mendocinaDSM50017|1|3813|4271|0.89|41|10|83|0.55|0.88|438|Ps.oleovoransB396|2|1671|3450|0.48|14|8|83|0.22|0.39|41|Ps.fluoreszensB340|3|868|4186|0.21|6|7|83|0.11|0.19|4|Ps.veroniiDSM11331|4|847|4250|0.20|5|7|83|0.10|0.14|3|Ps.putidaDSM291|5|374|2821|0.13|3|3|83|0.05|0.12|1|Ps.putidaB401|6|329|2638|0.12|3|2|83|0.05|0.11|1基于谱图模式比对的细菌鉴定应用软件BIOTYPER细菌鉴定结果的报告MALDI-TOF-MS技术鉴定微生物优势速度快，操作简单结果不受生长培养基影响，结果不受细菌生长状态影响重复性,稳定性好。(在标准条件下进行样本制备和测量后，在不同的MALDI-TOF仪器上获取的质谱谱图具有很高的可比性。)高通量，成本低。建立已知微生物的标准蛋白质组指纹质谱数据库取得微生物标准品的单克隆样品样品进行MALDI-TOFMS分析得到标准品质谱建立多种常规检测目标微生物质谱数据库未知样品通过MALDI-TOF-MS分析得到质谱未知样品质谱进入建立好的质谱数据库进行比对快速准确得到微生物鉴定结果match目前MALDI-TOF-MS在微生物鉴定中的应用医学临床微生物食品工业微生物动植物检疫微生物MALDI-TOF-MS技术在动植物检验检疫的前景前沿性实用性