HBV、HCV高精度核酸检测技术的临床意义

肝炎病毒PCR检测技术国内现状及最新进展暨HBV/HCV高精度核酸检测技术的临床意义主要内容PartⅠ荧光定量PCR技术简介PartⅡHBV/HCV核酸检测技术现状及进展PartⅢ临床对HBV/HCV检测技术的需求PartⅣHBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义PartⅠPCR技术简介病原学检测常用的实验室技术☆细胞培养与鉴定（“金标准”）、动物实验☆血清学、免疫学诊断技术☆电镜技术☆分子生物学诊断技术——PCRPCR技术简介多聚酶链式反应（PCR：PolymeraseChainReaction)Polymerase:DNA聚合酶PCR技术简介核裂变链式反应“链式反应”改变世界PCR技术简介PCR技术的诞生KaryB.Mullis（穆利斯（美））•1971：Khorana等提出在体外经DNA变性、引物杂交,再用DNA聚合酶延伸DNA的设想。•1983：Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。•1988：耐热DNA聚合酶（Taq）引入了PCR技术•1993：Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。PCR技术简介KaryB.Mullis（1944－）技术简介PCR技术简介PCR原理：实质就是体外基因复制技术PCR技术简介30次循环后靶序列扩增的数量10亿PCR技术分类常规PCR在PCR结束后对终点产物进行分析。巢式PCR多重PCRPCR结合限制性长度多态性分析（PCR-RFLP）PCR结合特异性寡合苷酸探针斑点杂交（PCR-ASO）PCR结合变性梯度凝胶（PCR-DGGE）PCR结合的单链构象多态性（PCR-SSCP）等分析技术荧光定量PCR（real-timePCR)通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件可以对结果进行分析,计算待测样品的初始模板量。实时检测PCR扩增，在扩增的指数期对起始模板进行定量。PCR技术简介荧光定量实时PCR与普通PCR的比较•实时在线监控对样品扩增的整个过程进行实时监控,能够实时地观察到产物的增加,直观地看到反应的对数期•降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合,提高了PCR反应的特异性•增加定量的精确性全程监控,准确的算法进行定量•结果分析更加快捷方便,无需跑胶PCR技术简介1、目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得目的基因片段提供了简便快速的方法。2、基因的体外突变：可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。PCR的应用3、DNA和RNA的微量分析：PCR技术高度敏感，对模板ＤＮＡ的含量要求很低，是DNA和ＲNA微量分析的最好方法。实际工作中，一滴血液、一根毛发或一个细胞已足以满足PCR的检测需要，因此在基因诊断方面具有极广阔的应用前景。4、基因转录水平检测RT-PCR可检测不同组织或细胞中基因的转录水平5、基因突变分析：利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。PCR技术简介PartⅡHBV/HCV核酸检测技术现状及进展HBV/HCV核酸检测技术现状及进展乙型肝炎检测标志物☆HBsAg,抗-HBs,☆HBeAG,抗-HBe,☆抗-HBc（IgG,IgM）,☆HBV-DNADNA4-12周1-2周2周－3月3－6月潜伏期急性早期潜伏后期急性期康复期痊愈标志物相对浓度有传染性可能有传染性有免疫力血清学转换期HBsAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBcIgMAnti-HBeAnti-HBs急性乙型肝炎各项生理指标DNADNA4-12周1-2周2周－3月3－6月潜伏期急性早期潜伏后期急性期康复期痊愈标志物相对浓度有传染性可能有传染性有免疫力血清学转换期HBsAgHBsAgHBeAgHBeAgAnti-HBcAnti-HBcAnti-HBcIgMAnti-HBcIgMAnti-HBeAnti-HBeAnti-HBsAnti-HBsHBV/HCV核酸检测技术现状及进展☆免疫学检测☆生物化学检测☆组织学检测☆分子生物学检测☆基因芯片乙肝病毒的检测方法HBV/HCV核酸检测技术现状及进展HBV/HCV核酸检测技术现状及进展HBV分子生物学检测☆HBV-DNA☆基因耐药突变检测☆基因分型☆HBVcccDNA☆HBV前C及核心启动子变异HBV/HCV核酸检测技术现状及进展检测种类检测方法临床意义HBV-DNA检测实时荧光定量PCR确诊HBV感染bDNA病始治疗方案确定竞争PCR治疗过程动态监测杂交捕获抗病毒治疗选择及监测预后评估基因耐药突变检测PCR产物直接测序可提高初始治疗效果焦磷酸测序克隆测序可预防或延缓核苷类似物耐药变异反向线性杂交PCR-RFLP耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现基因芯片HBV分子生物学检测方法及临床意义HBV/HCV核酸检测技术现状及进展检测种类检测方法临床意义基因分型检测同上鉴别HBV病毒A-H8个基因型各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同前C区及核心区启动子（BCP）突变检测同上与疾病预后有关，肝硬化及原发肝癌中均高发生核苷酸类似物耐药突变的危险因素cccDNA检测序列特异引物-跨reDNA双缺口PCR病毒复制中，双螺旋切口补齐，行程cccDNA，它是HBV前基因组RNA的转录模板，对HBV复制及感染有重要意义Southern印迹杂交HBV分子生物学检测方法及临床意义HCV的感染模型HBV/HCV核酸检测技术现状及进展丙肝病毒的检测方法☆血清生化学检测☆HCV抗体检测☆HCV核心抗原检测☆HCVRNA检测HBV/HCV核酸检测技术现状及进展检测种类检测方法临床意义HCV-RNA检测RNA-cDNA-PCR定性检测确诊HCV感染（特别是移植、血透、HIV合并）血筛（输血、生物制品）直接RNA扩增（NASBA）定量检测初始治疗依据治疗检测、疗效评估、方案调整实时荧光定量PCR预后评估（基线水平、RNA变化）基因分型检测PCR产物直接测序焦磷酸测序鉴别HBV病毒A-H8个基因型克隆测序liPA(可分5-10%混合型)各型与临床转归及抗病毒治疗反应不同PCR-RFLP基因芯片耐药检测同上可提高初始治疗效果可预防或延缓核苷类似物耐药变异耐药变异出现后联合治疗可预防多重耐药变异出现HCV分子生物学检测方法及临床意义HBV/HCV核酸检测技术现状及进展目前国内外乙肝主流基因诊断技术比较•除个别公司产品外，国内的检测技术在方法学、灵敏度以及准确性方面一般都远远落后于发达国家HBV/HCV核酸检测技术现状及进展常用DNA类标本处理方法煮沸法柱提取磁珠法一二裂解方法煮沸煮沸化学裂解化学裂解分离方法离心离心亲和吸附吸附或杂交步骤1.煮沸裂解2.离心，去除大分子的抑制物3.取上清扩增1.加入沉淀剂2.离心弃上清，浓缩标本并去除小分子抑制物3.煮沸裂解4.离心，取上清扩增，去除大分子抑制物。1.化学裂解2.过柱吸附3.洗涤4.洗脱5.取洗脱液扩增1.化学裂解2.加磁珠吸附3.洗涤4.洗脱5.取洗脱液扩增抗干扰能力差较差好最好提取物组分较小分子量的混合物与核酸相似分子量的混合物全核酸特定病原的核酸自动化程度手工手工手工或自动半自动或全自动HBV/HCV核酸检测技术现状及进展常用RNA类标本处理方法酚-氯仿提取柱提取原理液相萃取硅胶吸附步骤1、标本加裂解液加氯仿混匀，静置数分钟2、高速低温离心10-15分钟3、取上清加异丙醇4、高速低温离心10-15分钟5、弃上清，酒精洗涤6、高速低温离心5-10分钟7、弃上清，晾干8、加水，水浴，取样上机检测1、标本加裂解液加去抑制剂等混匀，热裂解10分钟。2、加入无水乙醇沉淀核酸3、整体移入柱，离心甩干或负压抽干4、加入洗涤液1，离心甩干或负压抽干5、加入洗涤液2，离心甩干或负压抽干6、加入洗脱液，高速离心1分钟7、取洗脱下来液体上机检测优点最经典提取方法核酸纯度高，无需高速离心不足操作繁琐，设备和人员操作要求高。低病毒载量标本检出率低。需频繁更换离心管，核酸丢失率高，特异性差。HBV/HCV核酸检测技术现状及进展高灵敏度的磁珠核酸纯化方法的比较比较项目圣湘磁珠法常规磁珠法备注更换EP管无需更换更换2-3次操作简化裂解1管裂解液、室温多管裂解液（加热）操作简化洗涤1次完成洗涤3-4次操作简化核酸洗脱无需洗脱加热洗脱操作简化HBV/HCV核酸检测技术现状及进展（圣湘）磁珠法HBV产品与国内外主流产品的比较HBV/HCV核酸检测技术现状及进展圣湘磁珠法HCV产品与国内外主流产品的比较25IU/mlHBV/HCV核酸检测技术现状及进展不同方法的HBVDNA检测下限以及不同标准要求比较项目检测下限线性范围备注卫生部要求1000IU/ml1000IU/ml-1E8IU/ml常规煮沸法500IU/ml500IU/ml-1E8IU/ml手工操作圣湘磁珠法10IU/ml20IU/ml-2E9IU/ml手工操作罗氏磁珠法12IU/ml30IU/ml-1.1E8IU/ml需要罗氏全自动核酸提取工作站美国肝病协会建议10IU/ml推荐罗氏HBV试剂HBV/HCV核酸检测技术现状及进展☆国内大部分检测试剂灵敏度≥1000Copies/ml，特异性、准确性等方也存在着严重缺陷，远远不能满足临床检测和用药监控的需求，这也是国内HCV研究进展缓慢的重要原因之一。HBV/HCV核酸检测技术现状及进展PartⅢ临床对HBV/HCV检测技术的需求“2008年美国肝病协会CHB防治指南”：持久消除HBV是乙肝的治疗终点，HBVDNA病毒载量尽可能小于或等于10IU/ml。临床对HBV/HCV检测技术的需求“欧洲肝病研究学会EASL2010年指南”指出：采用荧光实时PCR方法检测HBVDNA时，其灵敏度要小于或等于10-15IU/ml。临床对HBV/HCV检测技术的需求“欧洲肝病研究学会EASL2011指南”还指出：丙肝患者治疗的终点是HCVRNA病毒载量低于50IU/ml。临床对HBV/HCV检测技术的需求研究表明国产PCR试剂的灵敏度很难达到上述要求五种乙型肝炎病毒核酸荧光定量检测试剂盒的比较,中华传染病杂志，2009年第3期——吴星,黄维金,周诚,庄辉等(中国药品生物制品检定所,北京大学医学部)临床对HBV/HCV检测技术的需求国内行业指导原则•国家SFDA技术审评中心《HBVDNA定量试剂技术审评指导原则》中指出：HBVDNA最低检测限应≤30IU/ml临床对HBV/HCV检测技术的需求•国产很多乙肝PCR试剂的灵敏度为500IU/ml至1000IU/ml之间，丙肝试剂的灵敏度为在1000IU/ml以上。•从病毒性肝炎的早期诊断及适时确定治疗终点的临床需求看，现有的国产PCR试剂需要提高检测灵敏度。国内现状临床对HBV/HCV检测技术的需求PartⅣHBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义≥100,00010,000-99,999病人(%)13年随访累积肝癌的发生率[1](N=3653)504030201001.31.43.612.214.913年随访累积肝硬化的发生率[2](N=3582)4.55.99.823.536.2300300-9991000-9999300300-999910,000-99,999100,000-999,999≥1millionHBVDNA基线水平（copies/ml）HBVDNA基线水平较高增加肝硬化和肝癌的风险HBV/HCV高精度检测技术对肝病诊疗的临床意义持续高HBVDNA水平和肝癌发病增加相关baselineHBVDNA104≥105≥105≥105随访HBVDNA--104104to105≥105调整参照(95%CI)1.0(参照)3.6(1.7-7.6)6.9(3.4-13.