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第十一章柠檬酸循环柠檬酸(TCA)循环过程中关键的化合物是柠檬酸，因为柠檬酸有三个羧基，所以又称三羧酸循环（tricarboxylicacidcycle，TCA）。柠檬酸循环在细胞的线粒体中进行。柠檬酸循环不仅是糖的有氧分解代谢途径，也是脂肪酸和氨基酸的分解代谢途径，柠檬酸循环的中间物还是许多物质生物合成的前体。在无氧的条件下，葡萄糖经糖酵解反应获取能量，产生的丙酮酸被还原为乳酸(或酒精)：C6H12O6→→→2H3C-CHOH-COO－+2H＋△Go'＝-196kJ/mol但是，在有氧的条件下，葡萄糖则完全氧化成CO2和H2O，并产生细胞活性所需的大量的能量：C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O△Go'＝-2867kJ/mol这表明在糖的无氧分解产物中还蕴藏着极为丰富的能量，乳酸分子中还含有葡萄糖分子93%的可供利用的能量。在有氧的条件下，最终被氧化成CO2和H2O。这样的代谢过程称为呼吸(respiration)或细胞呼吸。因为这一过程消耗氧，释放出CO2。细胞呼吸可分为三个不同的阶段:第一阶段是葡萄糖经糖酵解转变成丙酮酸，丙酮酸再被氧化成乙酰CoA；对于细胞呼吸的其他有机燃料分子脂肪酸以及氨基酸，经相应的代谢途径亦可转变成乙酰CoA。第二阶段是指有机燃料分子氧化产生的乙酰CoA进入一个称为柠檬酸循环的代谢途径，被酶促转变成CO2，同时产生还原性的电子载体NADH和FADH2。第三阶段是指前两个阶段产生的还原性的NADH和FADH2被氧化，重新形成氧化型的辅酶。第一节丙酮酸氧化在有氧的条件下，糖酵解产生的丙酮酸或乳酸氧化产生的丙酮酸或者某些氨基酸分解产生的丙酮酸经特殊的载体蛋白转运到线粒体内，首先经氧化脱羧反应转变成乙酰CoA。一丙酮酸脱氢酶复合物丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA的反应是由丙酮酸脱氢酶复合物催化的。这个酶复合物由丙酮酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酰转乙酰基酶(E2)和二氢硫辛酰脱氢酶(E3)三种酶构成.每一种酶在该复合物中均有多个拷贝。大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合物分子量约4600kD,外形呈球形，其直径约为30nm。该复合物的核心由24个E2构成，24个E1和12个E3环绕E2排列。真核生物丙酮酸脱氢酶复合物比大肠杆菌的酶更为复杂。二丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应丙酮酸脱氢酶复合物催化五步顺序反应，其总反应是：CH3-CO-COO－＋CoA-SH＋NAD＋→CH3-CO～CoA＋CO2＋NADH在丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应中涉及五种不同的辅酶，它们分别是焦磷酸硫胺素(TPP)、硫辛酸(lipoicacid)、辅酶A(CoA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD＋)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。E1:丙酮酸脱氢酶E2:二硫辛酸转乙酰基酶E3:二氢硫辛酸转乙酰基酶丙酮酸脱氢酶系多酶体系，位于线粒体膜上。E.coli的丙酮酸脱氢酶系分子量：4.5×106，直径45nm，比核糖体稍大。酶辅酶亚基数丙酮酸脱氢酶（E1）TPP24二氢硫辛酰转乙酰酶（E2）硫辛酸24二氢硫辛酰脱氢酶（E3）FAD12此外，还需要辅酶A(CoA)、NAD+、Mg2+作为辅因子，辅酶A是重要的酰基载体。E1使丙酮酸脱羧生成羟乙酰－TPPE2从TPP上接受含负碳离子的羟乙酸交给CoA生成乙酰CoAE3辅基FAD从二氢硫辛酸上接受氢，然后转交给NAD+,生成NADH第二节柠檬酸循环柠檬酸循环(citricacidcycle)是乙酰基二碳单位进一步氧化降解产生CO2和还原型辅酶的代谢途径。由于该反应顺序是乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸开始的，且草酰乙酸经多步反应之后重新生成，构成了一个循环反应途径，因此，该循环反应称为柠檬酸循环。一.柠檬酸循环的研究历史柠檬酸循环处在物质代谢的中心位置，该途径的发现在生物化学发展史上占据着重要的位置。德国科学家HansKrebs在阐明柠檬酸循环中作出特殊贡献，1953年获得诺贝尔医学奖，柠檬酸循环又称Krebs循环。柠檬酸(三羧酸)循环概貌由丙酮酸形成的乙酰CoA或者是其它代谢途径（如脂肪酸或氨基酸的分解代谢途径）产生的乙酰CoA可以通过柠檬酸循环氧化，柠檬酸循环涉及八步酶促反应。二、柠檬酸循环的反应过程（一）柠檬酸的生成柠檬酸合酶(citratesynthase)催化乙酰CoA与草酰乙酸的缩合，生成柠檬酸.这是柠檬酸循环的起始反应。同位素标记实验表明，乙酰基上的甲基碳与草酰乙酸的羰基碳结合。柠檬酸合酶催化的反应遵循有序顺序反应机制。由于乙酰CoA是一种高能化合物，当硫酯键被水解时，可释放出大量的能量(△Go’=-32.5kJ/mol)，因而在细胞内能推动反应向柠檬酸生成的方向进行。柠檬酸合酶催化的反应是不可逆的，受到多种效应物的调节。柠檬酸合酶反应的机制（二）异柠檬酸的形成柠檬酸在顺乌头酸酶(aconitase)的催化下，异构化转变成异柠檬酸(isocitrate)。顺乌头酸(cis-aconitate)是这一转变反应的中间物。该步反应是可逆的，△Go'＝﹢6.3kJ/mol，反应有利于柠檬酸。因此，在平衡时，异柠檬酸大约只占10%。]顺乌头酸酶顺乌头酸酶柠檬酸是一种前手性分子，然而顺乌头酸酶却能对柠檬酸两端的两个相同的基团(-CH2-COO－)具有选择性。如反应式所指出的，脱水和加水反应只涉及到柠檬酸的下半部分(即来自草酰乙酸碳原子上的基团)。对这种选择的解释是：根据酶作用的立体专一性，酶分子活性中心是不对称的，有三个不同的结合位，这三个不同的结合位只有在与底物分子的三个不同的取代基互补配对时，该酶才能进行催化。柠檬酸的中心碳连接有四个取代基，其中两个是相同的(-CH2-COO－)。但是这两个相同的基团在空间取向上是不同的，也就是说在空间上是可以区别的。顺乌头酸酶的这种作用特性就解释了为什么后续的脱羧反应只发生在与乙酰基参入部位相对的碳位上，而不发生在乙酰基参入部位这一端。当柠檬酸与顺乌头酸酶的活性中心结合时，酶活性中心的微环境能区别在空间取向上不同的两个相同的基团，使得两个相同的基团中只有一个被酶作用，而另一个则不能被酶催化。（三）异柠檬酸的氧化脱羧异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧转变成α-酮戊二酸。这是柠檬酸循环的第一步脱羧反应。在该反应中伴随NAD＋还原产生NADH。注意，这里脱去的CO2来自原初的草酰乙酸部分，而不是乙酰CoA的乙酰基部分。在该酶的催化反应中，异柠檬酸的二级醇羟基氧化，转变成草酰琥珀酸(oxalosuccinate)，接着β-位羧基发生脱羧反应，生成α-酮戊二酸。Mn2＋在反应中起着使新形成的羰基极化的作用。这一反应的△Go'是-20.9kJ/mol，能有效地推动顺乌头酸酶催化异柠檬酸的生成反应。草酰琥珀酸是异柠檬酸脱氢酶催化反应的中间物，它只是瞬间存在。但是酶活性部位的残基(Tyr160和Lys230)如发生突变，则使该酶的活性降低(即产生动力学“瓶颈”)，造成反应中间物的积累而证实它的存在。在哺乳动物组织中也存在依赖于NADP＋的异柠檬酸脱氢酶。异柠檬酸脱氢酶的反应机制。Mn2+使草酰琥珀酸中间物上的羰基极化（四）α-酮戊二酸氧化脱羧产生琥珀酰CoAα-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱氢酶复合物的催化下，氧化脱羧，产生琥珀酰CoA，同时释放出CO2和NADH。这里，释放出CO2同样来自原初的草酰乙酸部分而不是来自乙酰CoA的乙酰基。如果说，顺乌头酸酶对柠檬酸的两个相同的基团没有选择性，α-酮戊二酸脱羧反应释放出CO2应有一半含有放射性标记，但是，实际结果没有。这证实了顺乌头酸酶具有选择性。α-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的反应在化学上与丙酮酸脱氢酶复合物相似。这个酶复合物也是由三种酶组成：α-酮戊二酸脱氢酶(E1)、二氢硫辛酰转琥珀酰基酶(E2)二氢硫辛酰脱氢酶(E3)。E1和E2作用的底物不同，这里E3与丙酮酸脱氢酶复合物的E3相同。α-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的是一个高度放能的反应(△Go'＝-33kJ/mol)，反应产生的琥珀酰CoA象乙酰CoA一样，含有一个高能硫酯键。（五）琥珀酰CoA氧化转变成为琥珀酸琥珀酰CoA合成酶(succinyl-CoAsynthetase)催化琥珀酰CoA裂解产生琥珀酸，并伴随高能磷酸化合物(GTP或ATP)的生成。该反应的△Go'约为–2.1kJ/mol。这是柠檬酸循环中唯一直接产生高能磷酸化合物的反应，是底物水平磷酸化的又一个例子。由于其逆反应能形成硫酯键，因此，该酶亦称之为琥珀酸硫激酶(succinatethiokinase)。在哺乳动物体内，该反应通常合成的是GTP；植物和细菌的琥珀酰CoA合成酶则通常合成ATP。哺乳动物体产生的GTP在核苷二磷酸激酶(nucleosidediphosphatekinase)催化下，可以将它末端的磷酸基转移到ADP上，生成ATP：GTP＋ADP←→GDP＋ATP琥珀酰CoA合酶催化的反应涉及到CoA被磷酸基取代，在该酶的活性部位形成琥珀酰基磷酸(succinylphosphate)。然后，磷酸基转移到酶活性部位的His残基上，形成磷酸组氨酸，并释放出琥珀酸；随后磷酸基被转移到GDP上，生成GTP。琥珀酰CoA合酶催化的反应（六）琥珀酸氧化形成延胡索酸琥珀酸氧化转变成延胡索酸是在琥珀酸脱氢酶(succinatedehydrogenase)催化下进行的。FAD作为该酶的辅基，共价结合在酶的一个His残基上，在酶促反应中接受底物氧化脱下的电子和氢。这一反应的自由能变化接近﹣6kJ/mol。琥珀酸脱氢酶是柠檬酸循环中唯一的线粒体内膜结合蛋白，也是琥珀酸-CoQ氧化还原酶的一部分。琥珀酸的氧化涉及从它中间两个碳原子的相反两侧各除去一个H原子。这一涉及烷氧化成烯的反应，没有足够的能量使NAD＋还原，但却能使FAD还原为FADH2。与此相反，醇、或酮的氧化反应，可以产生足够的能量推动NAD＋的还原。琥珀酸脱氢酶是一种由分子量为70kD和27kD两个亚基构成的二聚体蛋白。FAD共价地结合到大亚基上。琥珀酸脱氢酶也含有铁-硫簇。该酶催化的反应具有立体专一性，它只能催化琥珀酸从相反位置脱氢转变成延胡索酸(反丁烯二酸)或其逆反应，但不能催化琥珀酸从同一侧脱氢产生顺丁烯二酸或其逆反应。由于琥珀酸脱氢酶没有区分琥珀酸相同两端的能力，如果用于柠檬酸合成的乙酰基的羰基碳事先用14C标记，那么经上述6步反应生成的琥珀酸的羧基碳均应含有放射性标记，只不过每个羧基碳的放射性强度只保有原初标记的50%，其后每种化合物的羧基碳原子均同样如此。（七）延胡索酸的水合反应延胡索酸在延胡索酸酶(fumarase)催化下，双键水合生成L-苹果酸(L-malate)。所以延胡索酸酶也叫做延胡索酸水合酶(fumaratehydratase)。水合反应很可能先形成负碳离子的转换态形式。转换态形成中，首先受到OH－阴离子的攻击，形成负碳离子，接着发生质子(H＋)化反应。该反应△Go'＝-3.4kJ/mol。延胡索酸酶具有很高的立体专一性。它只作用于延胡索酸，从双键的相反方向加OH－和H＋，生成L-苹果酸，或者催化其逆反应，L-苹果酸脱水变成延胡索酸。该酶不能催化顺丁烯二酸加水变成苹果酸，也不能催化D-苹果酸的脱水反应。延胡羧酸水和反应的过程（八）草酰乙酸的生成苹果酸氧化转变成草酰乙酸是柠檬酸循环的最后一步反应。催化这一反应的酶是L-苹果酸脱氢酶(L-malatedehydrogenase))。该反应△Go‘＝+29.7kJ/mol，在热力学上不利于草酰乙酸的生成，而有利于逆向反应。因此，草酰乙酸在细胞内的浓度是很低的。但是，在细胞内，不利于草酰乙酸生成的反应可以被柠檬酸循环的第一步反应(由柠檬酸合酶催化)所推动，向有利于草酰乙酸生成的方向进行。因为柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸的缩合反应是高能放能的(△Go'＝-31.5kJ/mol)。苹果酸脱氢酶催化氢负离子转移到NAD＋的机制与乙醇脱氢酶和乳酸脱氢酶相似。X-射线分析表明，这三种酶的NAD＋结合域具有显著的相似性，与NAD＋结合域从一个共同的祖先进化的观点是一致的。苹果酸脱氢生成草酰乙酸三.TCA循环