生物化学 第十章 酶的作用机制和酶的调节

2006-1-7上海大学生命科学学院第十章酶的作用机制和酶的调节一、酶的活性部位二、酶催化反应的独特性质三、影响酶催化效率的有关因素四、酶催化反应机制的实例五、酶活性的调节控制六、同工酶2006-1-7上海大学生命科学学院一、酶的活性部位活性中心：酶分子中结合底物并起催化作用的少数氨基酸残基，包括底物结合部位（决定酶的专一性）、催化部位（决定酶所催化反应的性质）。频率最高的活性中心的氨基酸残基：Ser、His、Cys、Tyr、Asp、Glu、Lys。不需要辅酶的酶：活性中心是酶分子在三维结构上比较靠近的少数几个氨基酸残基或是这些残基的某些基团。需要辅酶的酶：辅酶分子或辅酶分子的某一部分结构往往就是活性中心的组成部分。（一）酶活性部位的特点2006-1-7上海大学生命科学学院接触残基：R1、R2、R6、R8、R9、R163辅助残基：R3、R4、R5、R164、R165结构残基：R10、R162、R169非贡献残基：其它2006-1-7上海大学生命科学学院酶蛋白必需残基非必需残基活性中心活性中心外接触残基辅助残基结构残基结合残基催化基团（1）接触残基：结合基团，催化基团。（2）辅助残基：不与底物接触，辅助酶与底物结合，协助接触残基。上述两类残基构成酶活性中心。（3）结构残基：维持酶分子三维构象，与酶活性相关，但不在酶活性中心范围内，属于酶活性中心以外的必需残基。上述三类残基统称酶的必需基团（4）非贡献残基（非必需基团）可能在免疫，酶活性调节，运输转移，防止降解等方面起作用。2006-1-7上海大学生命科学学院酶活性部位的特点：（1）活性部位在酶分子的总体中只占相当小的部分，往往只占整个酶分子体积的1%-2%；（2）酶的活性部位是一个三维实体，具有三维空间结构。活性中心的空间构象不是刚性的，在与底物接触时表现出一定的柔性和运动性。（邹承鲁研究酶变性的工作）（3）通过诱导契合酶和底物结合；（4）酶的活性部位是位于酶表面的一个裂隙内，裂隙内是一个相当疏水的环境，从而有利于同底物的结合；（5）底物通过次级键较弱的力结合到酶上。2006-1-7上海大学生命科学学院（二）研究酶活性部位的方法（1）通过酶的专一性：研究酶的专一性底物的结构特点、酶的竞争性抑制剂结构特点等。（2）酶的化学修饰法：例如1.用共价修饰的试剂作用于酶，查明保持酶活力的必需基团；2.亲和标记（合成底物类似物）；3.—SH保护剂的使用。（3）X射线晶体衍射法（4）分子生物学的方法2006-1-7上海大学生命科学学院二、酶催化反应的独特性质（1）酶反应分为两类：仅涉及电子转移和涉及电子和质子两者或者其他基团的转移。（2）催化作用是以氨基酸侧链上的功能基团和辅酶为媒介。（3）酶催化反应的最适pH范围通常狭小。（4）酶分子很大，而活性部位通常只比底物稍大一些，一个巨大的酶结构对稳定活性部位的构象是必要的。（5）酶具有复杂的折叠结构。2006-1-7上海大学生命科学学院三、影响酶催化效率的有关因素（一）底物和酶的邻近效应与定向效应邻近效应：酶与底物形成中间复合物后使底物之间、酶的催化基团与底物之间相互靠近，提高了反应基团的有效浓度。定向效应：由于酶的构象作用，底物的反应基团之间、酶与底物的反应基团之间正确取向的效应。酶把底物分子从溶液中富集出来，使它们固定在活性中心附近，反应基团相互邻近，同时使反应基团的分子轨道以正确方位相互交叠，反应易于发生。2006-1-7上海大学生命科学学院邻近效应与定向效应对反应速度的影响：①使底物浓度在活性中心附近很高②酶对底物分子的电子轨道具有导向作用③酶使分子间反应转变成分子内反应④邻近效应和定向效应对底物起固定作用2006-1-7上海大学生命科学学院（二）底物的形变和诱导契合酶中某些基团可使底物分子的敏感键中某些基团的电子云密度变化，产生电子张力，降低了底物的活化能。①酶从低活性形式转变为高活性形式，利于催化。②底物形变，利于形成ES复合物。③底物构象变化，过度态结构，大大降低活化能。2006-1-7上海大学生命科学学院ZnZnGlu270Tyr248Arg145底物羧肽酶结合底物前后构象变化2006-1-7上海大学生命科学学院（三）酸碱催化酶分子的一些功能基团起瞬时质子供体或质子受体的作用。影响酸碱催化反应速度的两个因素⑴酸碱强度(pK值）。组氨酸咪唑基的解离常数为6，在pH6附近给出质子和结合质子能力相同，是最活泼的催化基团。⑵给出质子或结合质子的速度。咪唑基最快，半寿期小于10-10秒2006-1-7上海大学生命科学学院（四）共价催化酶作为亲核基团或亲电基团，与底物形成一个反应活性很高的共价中间物。酶亲核基团：Ser-OH，Cys-SH，His-N、Asp-COOH；底物亲电中心：磷酰基（-P=O），酰基（-C=O），糖基（Glu-C-OH）某些辅酶，如焦磷酸硫胺素和磷酸吡哆醛等也可以参与共价催化作用。催化剂通过与底物形成反应活性很高的共价过渡产物，使反应活化能降低，从而提高反应速度的过程，称为共价催化。2006-1-7上海大学生命科学学院（五）金属离子催化金属酶（metalloenzyme):含紧密结合的金属离子，Fe2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+。金属-激活酶（metal-activatedenzyme):含松散结合的金属离子，Na+、K+、Mg2+、Ca2+。金属离子参加的四种主要催化途径（1）通过结合底物为反应定向（2）通过自身价数的改变参加氧化还原反应（3）屏蔽底物或酶活性中心的负电荷（4）金属离子通过水的离子化促进亲核催化。2006-1-7上海大学生命科学学院（六）多元催化和协同效应在酶催化反应中，常常是几个基元催化反应配合在一起共同起作用。2006-1-7上海大学生命科学学院（七）活性部位微环境的影响⑴疏水环境介电常数低，加强极性基团间的作用。⑵电荷环境在酶活性中心附近，往往有一电荷离子，可稳定过渡态的离子2006-1-7上海大学生命科学学院四、酶催化反应机制的实例（一）溶菌酶（lysozyme）NAG:N-乙酰氨基葡萄糖NAM:N-乙酰氨基葡萄糖乳酸溶菌酶-底物复合物酶切位点溶菌酶活性中心与底物结合示意图Asp52Glu35（极性区）（非极性区）溶菌酶催化反应机理C1+非极性区极性区HO-E环H2O（广义酸碱催化）2006-1-7上海大学生命科学学院（二）RNaseARNase-底物复合物RNase活性中心的酸碱催化机理核糖核酸链受Rnase水解的位点2006-1-7上海大学生命科学学院（三）羧肽酶A羧肽酶活性中心Zn2+的中心作用2006-1-7上海大学生命科学学院羧肽酶活性中心必需基团与底物间的结合2006-1-7上海大学生命科学学院ZnZn羧肽酶结合底物前后构象变化2006-1-7上海大学生命科学学院羧肽酶活性中心的共价催化机理1452006-1-7上海大学生命科学学院（四）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶）胰凝乳蛋白酶分子中催化三联体构象His57Asp102Ser195Asp102His57Ser195His57102AspSer195A.酶分子中的电荷中继网B.加上底物后，从Ser转移一个质子给His，带正电荷的咪唑基通过带负电荷的Asp静电相互作用被稳定Ser195102AspHis57底物2006-1-7上海大学生命科学学院氢键体系-电荷中继网胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（1）结合底物His57质子供体形成共价ES复合物C-N键断裂底物胰凝乳蛋白酶反应的详细机制（2）氨基产物释放四面体中间物的瓦解水亲核攻击羧基产物释放H2OR-NH22006-1-7上海大学生命科学学院五、酶活性的调节控制（一）别构调控概念：酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节(allostericregulation)，具有这种调节作用的酶称别构酶(allostericenzyme)。别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物(effector)，通常为小分子代谢物或辅因子。如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(positiveeffector)或别构激活剂，反之称负效应物(negativeeffector)或别构抑制剂。别构调节普遍存在于生物界，许多代谢途径的关键酶利用别构调节来控制代谢途径之间的平衡，研究别构调控有重要的生物学意义。A--非调节酶B-正协同别构酶的S形曲线别构酶与米氏酶的动力学曲线比较当底物浓度发生很小的变化时，别构酶就极大地控制着反应速度。在正协同效应中使得酶反应速度对底物浓度的变化极为敏感。2006-1-7上海大学生命科学学院区分酶的类型有两种标准a.Koshland标准：CI（cooperativityindex）协同指数：酶分子中的结合位点被底物饱和90%和10%时底物浓度的比值。亦称饱和比值Rs(saturationratio)Rs=酶与底物结合达90%饱和度时底物浓度酶与底物结合达10%饱和度时底物浓度Rs=81米氏类型酶Rs81具有正协同效应的别构酶Rs81具有负协同效应的别构酶b.Hill系数：Hill系数=1米氏类型酶Hill系数1具有正协同效应的别构酶Hill系数1具有负协同效应的别构酶1--非调节酶2--正协同别构酶3--负协同别构酶正、负协同别构酶与非调节酶的动力学曲线比较具有负协同效应的酶在底物浓度较低的范围内酶活力上升快，但再继续下去，底物浓度虽有较大的提高，但反应速度升高却较小。使得酶反应速度对底物浓度的变化不敏感天冬氨酸转氨甲酰酶（ATCase）ATCaseATP+氨甲酰磷酸天冬氨酸CTP-UTPUMP氨甲酰天冬氨酸2006-1-7上海大学生命科学学院E.coli的ATCase的亚基排列c:催化亚基（catalyticsubunit）r:调节亚基（regulativesubunit）2006-1-7上海大学生命科学学院ATCase半分子（c3r3)的结构2006-1-7上海大学生命科学学院ATCase的别构过渡作用低催化活性构象T(tense)-态CCCCCCRRRRRRCCCCCC高催化活性构象R(relax)-态RRRRRRPALA2006-1-7上海大学生命科学学院PALA(N-磷乙酰-L-天冬氨酸)结合到ATCase活性中心的模型ATCase变构效应的动力学特征ATP（正效应剂）CTP（负效应剂）低催化活性构象T(tense)-态CCCCCCRRRRRRCCCCCC高催化活性构象R(relax)-态RRRRRRVmax1/2VmaxKm别构酶的齐变模型SSSSSSSSSST状态（对称亚基）R状态（对称亚基）SSSS对称亚基对称亚基齐步变化2006-1-7上海大学生命科学学院别构酶的序变模型SSSSSSSSSSSSSS亚基全部处于R型亚基全部处于T型依次序变化2006-1-7上海大学生命科学学院（二）酶的共价修饰某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶。由于这种调节的生理意义广泛，反应灵敏，节约能量，机制多样，在体内显得十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联放大反应，所以日益引人注目。AP1GEDCBHEa-bEc-dEc-g关键酶（限速酶）P22006-1-7上海大学生命科学学院蛋白质的磷酸化和脱磷酸化蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶nPiH2O第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型第一类：Ser/Thr型第二类：Tyr型第三类：双重底物型反应类型共价修饰被修饰的氨基酸残基共价修饰反应的例子磷酸化腺苷酰化尿苷酰化Tyr,Ser,Thr.HisTyrTyr甲基化GluS-腺苷-MetS-腺苷-同型CysATPADP肾上腺素或胰高血糖素132102104106108葡萄糖456级联系