远场超分辨随机光子重建显微镜

远场超分辨随机光重建显微镜的研究LOGO随机光学重建显微镜（STORM）STORM成像基础2STORM成像技术33D-STORM技术4多色STORM技术5存在的问题和解决的途径6前言1LOGOfD22.1fD22.11前言背景大到天文光学望远镜观察浩瀚的宇宙，小到光学显微镜探察细微的纳米世界，光学成像技术在人类探索和发现未知世界的活动中扮演着至关重要的角色，看得更远、看的更细、看的更清楚使人们不断追求的目标。传统光学理论已证明所有经典光学系统都是一个衍射受限系统。瑞利判据：δ＝１．２２（λ／Ｄ）ｆLOGO能否突破这个极限能否不断提高光学系统的成像分辨率前言1LOGO•一方面，通过共聚焦/非线性等光学理论和光学系统的优化设计•另一方面，利用蛋白相互作用进行高分辨成像的荧光成像技术a、激光共聚焦显微镜（LSCM）b、非线性激发荧光的双光子荧光显微镜c、4Pi共焦扫描显微镜基于荧光共振能量转移（FRET）显微镜前言1为了提高远场显微成像的空间分辨率，已有许多方法和手段，LOGOSTED基于非线性光学效应，需要高功率脉冲激光，易导致损害样品。缺点•利用受激辐射选择性消耗点扩散函数边沿区域的激发态荧光分子从而压缩点扩散函数衍射斑的直径以上远场显微成像技术都没有打破衍射极限的限制，真正打破远场衍射极限的技术是受激发射损耗（STED）显微镜、饱和结构光照明显微镜（SSIM）、随机光子重建显微镜（STORM）。前言1SSIM·利用CCD采集根据栅格线的不同位置对应投影图像，通过软件计算，获得杂散荧光的图像，图像反差和锐利度得到明显改善。LOGOSTORM成像基础21、单分子定位对物体成像虽然受限于显微镜分辨能力，但对于荧光分子定位分析只要有足够的光子数(N)被接收，分析荧光激发光子光强分布的中心可以实现高精度的粒子定位。STORM成像两个关键技术：单分子定位和光控开关荧光分子LOGOSTORM成像基础2)812/(222422NabsNaNskkk由上式可知，噪声来源有中心点光子的散粒噪声，有限像素尺寸的影响和由焦点外荧光、CCD读取噪声、暗电流等因素产生的背景噪声。在对Cy3DNA定位研究中，采用物镜型全内反射显微镜，在积分时间0.5s，接收光子数量14200个，像素尺寸a=86nm，背景噪声b=11，PSF分布标准差(FWHM)sx=125nm，sy=122nm的条件下进行。LOGOSTORM成像基础2以上数据带入公式，只考虑第一项散粒噪声时σμ=1.02nm，增加第二项像素大小对定位精度的影响后σμ增加到1．04nm，再增加背景噪声σμ增加到1.24nm。由此可以知道PSF的重心定位精度可以达到纳米量级。散粒噪声是决定定位精度的主要因素LOGO532nm激光激发下632nm激光激发下TextinhereCy5非荧光态荧光态荧光分子对Cy3和Cy5，在532nm和632nm激光激发下在荧光态和非荧光态间转换STORM成像基础22、光控开关荧光分子LOGOSTORM成像基础2图Cy5荧光分子与激发的荧光开关LOGOSTORM成像基础2（b）（c）a)单分子光开关的原理图;b)下图:红激光连续开，绿激光周期开关，有效开关Cy5荧光分子;上图:Cy5荧光分子被绿激光开关的时间序列;c)在b)所示的激光输出特性下对单个Cy5分子荧光成像。LOGO随机光重建显微镜（STORM）使用不同颜色的光开关高精度的独立荧光分子重建得到荧光图像。STORM成像过程包括一系列的成像循环，在每个循环中视场中只有一部分荧光分子被激发，产生荧光发光，这个激活的荧光分子可以从其他未被激活的荧光分子中分辨出来，这些图像不重叠，就可以使得荧光分子被高精度地定位。重复多次这样的循环，每个荧光分子都随机地被激发，记录，所有的荧光分子位置信息再通过光学重建出来。STORM成像技术3LOGOSTORM成像技术3a)用一个假设的被红绿激光开关荧光和暗态转换的红色荧光标记的六个扇形目标。b)DNA上标记的光漂白前可以开关循环几百次的单个Cy5。LOGOSTORM成像技术3单分子定位成像技术中图像重构过程示意图LOGO传统显微镜在光传播方向（Z轴）上的点扩散函数的半峰宽度为，小于xy平面的半高宽度，因此，理论Z轴分辨率本来就低于XY轴上的分辨率，且对厚的生物样本进行显微三维成像时，由于样本本身的折射系数与物镜折射系数不同，在Z轴方向上产生球面象差，从而是图像在Z轴上的分辨率降低。所以要观察细胞内的三维精细图像，就必须大幅度提高Z轴方向分辨率。sin2n2sin2n3D-STORM技术4LOGO基于单荧光显微成像STORM技术改进Z轴上的分辨率利用散光的原理来提取Z轴方向上的精细信息，具体方法是在成像物镜和图像透镜之间加上一个散光的柱面镜，从而产生XY轴向上的光程差。当点光源位置在聚焦平面时投射到CCD上的光斑与正常的显微镜一样，都是一个四面对称的圆形当点光源位置不在聚焦平面时投射到CCD上的点扩散光斑呈椭圆形，椭圆的长轴指向和长度分别决定了点光源位置在聚焦平面的上下以及离聚焦平面的距离3D-STORM技术4LOGO3D-STORM技术4LOGO多色STORM技术5基于Cy3-Cy5光可控开关荧光蛋白对基础，建立Cy3的一系列蛋白对，在不同波长激光激发下，产生不同荧光发射特性，实现多色荧光成像分析LOGO多色STORM技术5LOGOSTORM显微镜每次定位一个荧光分子，为了保证定位精度，要收集足够的光子数量，所以对衍射极限内所有的荧光按照这样的程序成像后重一幅完整的衍射极限内的图像，所需时间较长，只能研究固定的或时间分辨率要求不高的生物样品.存在的问题和解决的途径6问题解决方法采用时分复用技术即在相同时刻同时定位不同位置的荧光分子开发新型的、高通量的光可控开关荧光分子，单位时间内激发的荧光光子数量提高，缩短光子采集时间采用光中继来提高光子接收数量LOGO