CRISPR科普版PPT

01020403CONTENTSCRISPR一项伟大的成果，就是能够为普通人所掌握的，而尚未发现的规律！CRISPR：Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats成簇规律间隔短回文重复序列系统CRISPR:spacers(间隔序列）+directrepeats（重复序列）基因座结构：5’---tracrRNA---Cas9----CRISPR---3’tracrRNA:trans-activatingCRISPRRNAcrRNA:CRISPRRNA(pre-crRNA)Cas9：CRISPRassociatedendonuclease9sgRNA:single-guideRNAPAM序列：protospaceradjacentmotif原间隔序列临近基序DSBs:double-strandbreaks双链DNA缺口NHEJ:nonhomologousend-joining非同源末端连接HDR：homology-directedrepair同源重组修复2.1相关名词sgRNAProtospacer--PAM•外源DNA原间隔序列视频：CRISPR-Cas9基因编辑的原理（张锋亲自参与制作）网址：=MzI2NDAzMTQ2OA==&mid=2650023610&idx=1&sn=7f266aacaa41aee126254adb1fdbca8a&scene=02.2CRISPR的原理2.3从结构生物学角度解析CRISPR系统Cas9bindsDNAandgRNA（视频）2.4一些有意思的东西…CONTENTS目录PARTONE第一部分PARTTWO第二部分PARTTHREE第三部分PARTFOUR第四部分行业分析项目目的进度安排预算需求他们说，还有未被CRISPR染指的物种吗？改造人类胚胎•《Protein&Cell》中山大学基因功能研究人员黄军•两篇代表性的论文推荐CONTENTS目录PARTONE第一部分PARTTWO第二部分PARTTHREE第三部分PARTFOUR第四部分行业分析项目目的进度安排预算需求中国开启全球首个CRISPR基因编辑人体实验相关链接：=SFB_NNEWS_1508_RHBox基因编辑天才张峰•基因黑客张锋!《纽约客》万字长文讲述CRISPR背后的隐秘江湖！韩总的NgAgoVS.CRISPR•基因黑客张锋!《纽约客》万字长文讲述CRISPR背后的隐秘江湖！1234基因敲除基因表达调控基因产物定位Genome-Scale5CRISPRiApplications1基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•Target设计：在你的目的位置附近找到NGG然后找到其紧邻的上游20nt一般选择距离起始密码子ATG下游200bp范围内的exon区域Cas9的切割位点刚好被一个酶切位点跨过预测：Zifit；合成两条配对的普通oligo，请注意突出的粘性末端以及补加的一个转录起始位点G。gDNA设计Applications1基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•1.AnnealingOligos2.Ligation3.Transformationandpickupclonesforseq.4.Midi-prepareplasmidfortransfection.gDNA设计克隆构建Applications1基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•gDNA设计克隆构建(LukaszSwiech.et.al.2014)病毒包装Applications1基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•gDNA设计克隆构建病毒包装目的细胞系的感染/转染1.转染：（2mgplasmid/60mmdish，细胞密度60-80%）【v2=lentiCRISPRv2，下同】2.感染：（1-5ml病毒上清）Applications1基因敲除Knockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•1.直接测序、T7E1或者酶切鉴定2.WB鉴定Ps:脱靶效率鉴定3.表型、行为学层面Eg:contextualfear-conditioningparadigm(LukaszSwiech.etal,2014)gDNA设计克隆构建病毒包装目的细胞系的感染/转染KO效率鉴定2基因表达调控ApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•上调或下调基因表达(FranciscoJ.Sánchez-Riveraetal,2015)gDNA设计克隆构建病毒包装目的细胞系的感染/转染KO效率鉴定2基因表达调控ApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•gDNA设计克隆构建病毒包装目的细胞系的感染/转染KO效率鉴定(FranciscoJ.Sánchez-Riveraetal,2015)3基因产物定位ApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•gDNA设计克隆构建病毒包装目的细胞系的感染/转染KO效率鉴定基因产物定位有时候，我们想知道基因产物定位怎么办？融合标签啊！怎么融合？同源重组修复能帮到你！Cas9引入双链DNA断裂，同源介导修复（HDR）就能帮你把转进细胞的同源片段插入切割位点上！4GENOME-SCALEApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•gDNA设计克隆构建病毒包装目的细胞系的感染/转染KO效率鉴定相关文献：Genome-ScaleCRISPR-Cas9KnockoutScreeninginHumanCells(Science2014)Genome-scaletranscriptionalactivationbyanengineeredCRISPR-Cas9complex基因组规模5CRISPRiApplicationsKnockout,GeneExpressionRegulation,Orientation,Gome-scale,CRISPRi•gDNA设计克隆构建病毒包装目的细胞系的感染/转染KO效率鉴定图片来源：=c40a9b64278d97de3ac7beb7581dcd75&__biz=MzA4MTM0NDkwNQ==&mid=208055366&idx=1&scene=23&srcid=0810wdUHTued2oIXKYwWLgkc#rd=你或许了解RNAi，那么关于CRISPRi…•构建癌症疾病动物模型•你可以用它研究抑癌基因、耐药基因、致癌基因……让你成为癌症研究的佼佼者。CRISPR&CAR-T•基因编辑、免疫疗法与癌症之间的“三角关系”•参考资料相关网页=MzI2NDAzMTQ2OA==&mid=2650023610&idx=1&sn=7f266aacaa41aee126254adb1fdbca8a&scene=0（基因黑客张锋!《纽约客》万字长文讲述CRISPR背后的隐秘江湖）（CRISPR基因编辑技术及张锋的贡献）=c40a9b64278d97de3ac7beb7581dcd75&__biz=MzA4MTM0NDkwNQ==&mid=208055366&idx=1&scene=23&srcid=0810wdUHTued2oIXKYwWLgkc#rd=(“全能”与“功能”的邂逅)=MzI0NzExMTg0NQ==&mid=2649394843&idx=1&sn=1199decf9215e2e93e471fcf7baec00f&scene=2&srcid=0624OWUVFs97LE0CUDD38Wbr&from=timeline&isappinstalled=0#rd（CRISPR/Cas9系统操作实例）参考资料参考文献1.李苗苗.两种基因定点敲除技术TALEN和CRISPR在拟南芥中的应用[D].浙江大学,2014.2.支大龙.利用CRISPR/Cas9对小鼠胚胎进行基因敲除以及食蟹猴精子的冷冻保存[D].昆明理工大学,2015.3.张景洲.基于CRISPR/Cas9技术建立ATRX基因敲除的HeLa细胞系[D].北京协和医学院;北京协和医学院;清华大学医学部;中国医学科学院,2015.4.HsuP,LanderE,ZhangF.DevelopmentandApplicationsofCRISPR-Cas9forGenomeEngineering[J].Cell,2014,157(6):1262-78.5.NishimasuH,RanFA,HsuP,etal.CrystalStructureofCas9inComplexwithGuideRNAandTargetDNA[J].Cell,2014,156(5):935-49.6.KonermannS,BrighamMD,TrevinoAE,etal.Genome-scaletranscriptionalactivationbyanengineeredCRISPR-Cas9complex[J].Nature,2015,517(7536):583-8.7.ShalemO;SanjanaNE;HartenianE;ShiX;ScottDA;MikkelsenTS;HecklD;EbertBL;RootDE;DoenchJG;ZhangF.Genome-scaleCRISPR-Cas9knockoutscreeninginhumancells.[J].Science,2014,343(6166):84-87.8.Sánchez-RiveraFJ,JacksT.ApplicationsoftheCRISPR-Cas9systemincancerbiology[J].NatureReviewsCancer,2015,15(7):387-95.致谢：1111[关注生命科学领域的你][PPT借鉴：利兄（营销新人）李益达（逼格PPT）][实验流程整理：冰糖][CRISPR技术，这个伟大的发明]