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第五章细胞培养的基本技术第一节、培养细胞的取材和分离一、培养室内的无菌操作（1）培养前的准备（2）培养室和超净台的消毒（3）洗手和着装（4）无菌培养操作二、培养细胞的取材（1）取材的基本要求A、取材的组织最好尽快培养。B、取材时应严格无菌消毒。C、取材和原代培养时要用锋利的器械如手术刀片切碎组织，尽量减少对细胞的机械损伤。二、培养细胞的取材（1）取材的基本要求D、对于血液、脂肪、结缔组织和坏死组织等，取材时要细心除去。E、胚胎组织较成熟个体的组织容易培养，分化地的较分化高的组织容易生长，肿瘤组织较正常组织容易培养。二、培养细胞的取材（2）组织材料的分离目前常用分散组织的方法有机械法和化学法两种二、培养细胞的取材（2）组织材料的分离A、细胞悬液的分离方法如材料为血液、羊水等细胞悬液时，一般采用低速离心方法。（2）组织材料的分离B、组织块的分离方法a、机械分散法（2）组织材料的分离B、组织块的分离方法b、剪切分离法（2）组织材料的分离B、组织块的分离方法c、消化分离法消化法是结合生化和化学手段把已剪切成较小体积的组织进一步分散的方法。胰蛋白酶法、胶原酶法、EDTA法三、细胞的计数血球计数板16中格×25小格计算公式：细胞数/ml=100小格内细胞个数/100×400×10000×稀释倍数25中格×16小格计算公式：细胞数/ml=80小格内细胞个数/80×400×10000×稀释倍数在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如细胞位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。第二节原代培养原代培养：是从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养。原代培养分为：一、组织块培养法二、消化培养法三、器官培养法一、组织块培养法组织块培养法是常用的、简便易行和成功率较高的原代培养方法。即将组织剪切成小块后，接种于培养瓶。一、组织块培养法步骤：1、取材修剪冲洗2、剪成1mm3左右的小块3、移入培养瓶4、间距5mm分布组织小块5、翻转培养瓶37℃静止1-2h6、翻正培养瓶培养7、原代细胞培养一、组织块培养法二、消化培养法1、消化分离法消化细胞2、镜检，发现组织已分散成细胞团或单个细胞，终止消化，筛网过滤，大块继续消化。3、过滤的消化液，低速离心，加培养液，细胞计数后，接入培养瓶。第三节传代培养和细胞系的维持传代培养的原因？原代培养后，由于细胞数量增加，整个培养器皿，逐渐被细胞覆盖，如果不进行传代培养细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞生长。一、原代培养的首次传代传代：细胞由原代培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称为传代。二、细胞传代方法1、贴壁细胞的消化法传代二、细胞传代方法1、贴壁细胞的消化法传代（1）吸出或倒掉瓶内的旧培养液。（2）加入适量的消化液消化。（3）镜检，发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，应立即终止消化（4）吹打瓶壁细胞，制成细胞悬液（5）技术，接种到新的培养瓶。二、细胞传代方法1、悬浮细胞的传代悬浮细胞多采用离心方法传代，即将细胞连同培养液一并转移到离心管内，800-1000rpm离心5min,然后取出上清，加入新的培养液到离心管内，用吸管吹打使之形成细胞悬液，然后传代接种。细胞系的维持是通过换液，传代，再换液、再传代和细胞冻存实现的。三、培养细胞的维持细胞系的维持注意的要点：1、细胞系档案要记录好。2、细胞系的传代、换液一般都有自身的规律性，要注意保持其稳定的规律性。3、多种细胞系维持传代，要严格操作程序，以防细胞之间交叉污染。4、每一种细胞都应有充足的冻存储备。四、细胞培养的常规检查1、检查营养液的pH值。新鲜培养液呈橙红色（pH7.2）细胞生长旺盛，代谢产生的酸性物质积累增多，营养液酸化变黄，pH下降四、细胞培养的常规检查2、细胞污染的检查。细菌污染检查真菌污染支原体污染细胞交叉污染化学物质污染四、细胞培养的常规检查3、健康细胞与衰老死亡细胞的观察五、细胞冻存、复苏及运输细胞冻存原则：慢冻快融常用的冷冻保护剂：甘油或二甲基亚砜（DMSO）冻存细胞加入保护剂的原因?在冷冻时细胞内的水分会形成冰晶，如果细胞内的冰晶形成较多，体积膨胀造成DNA的空间构型发生不可逆的损伤性变化，引起细胞死亡。保护剂溶解度大，易穿透细胞，提高胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻方法可使细胞内的水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少细胞内的冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。1、细胞冻存流程1、细胞冻存流程1、细胞冻存流程1、细胞冻存流程1、细胞冻存流程1、细胞冻存流程细胞冻存流程1、选择对数生长期的细胞。2、用胰蛋白酶把单层细胞消化下来。3、细胞收集于离心管、计数、离心。4、加入培养基，使终浓度为5×106～1×107个/ml。分装入无菌冻存管中，每管加入细胞培养液0.9ml，在加入0.1ml德DMSO。2、细胞复苏流程2、细胞复苏流程2、细胞复苏流程2、细胞复苏流程2、细胞复苏流程1、将冻存的细胞自液氮中小心取出，迅速放入37℃水浴中，2、在1min内使冻存的细胞解冻，3、离心弃上清，移入培养瓶中。4、37℃，5%CO2温箱中培养5、次日换液，弃去漂浮的死亡细胞。2、细胞复苏流程3、细胞的运输1、运输细胞方法（1）一种为冷冻储存运输，即利用特殊容器内盛液氮或干冰冻存，保存效果好，但较麻烦，且不易长时间运输，多需空运。（2）一种为充液法。3、细胞的运输2、长距离运输（几天）（1）选择生长良好的单层细胞，去掉培养液，补充新培养液至瓶颈部，保留微量空气，凝紧瓶盖。这样可避免由于液体晃动导致的细胞损伤。（2）瓶口用胶带缠紧密封，用棉花包裹，（防震防压处理）放入器皿中。（3）到达后，吸出多余培养液，保留细胞生长所需液量，常规培养数小时或过夜。3、细胞的运输3、短距离运输（几小时）去掉大部分生长液，仅留少量液体覆盖单层细胞，防止细胞干燥，将细胞面朝上带回。