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2020/1/281五、固定化方法与载体的选择依据1、固定化方法的选择⑴固定化酶应用的安全性：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可选择无毒性试剂。⑵固定化酶在操作上中的稳定性：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。⑶固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设备和劳务投资等。2020/1/282五、固定化方法与载体的选择依据2、载体的选择为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；若底物不完全溶解或粘度大，宜采用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。2020/1/283六、固定化酶的形状与性质1、固定化酶的形状⑴颗粒状：包括酶株、酶块、酶片、酶粉、每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，使用各种反应器。⑵纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适合于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。2020/1/284⑶膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、过氧化酶、脲酶等酶膜。⑷管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如尼龙，聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联的酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶等酶管。2020/1/2852、固定化酶的性质⑴酶活力的变化酶经过固定化之后活力大都下降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。2020/1/286⑵酶稳定性的变化包括对温度、pH、蛋白酶变性和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。A、操作稳定性：是酶能否实际应用的关键因素。常用半衰期表示，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。通常半衰期达到1个月以上时，即具有工业应用价值。B、贮藏稳定性：一般不能长期贮存，现做现用，否则活力逐渐下降，若需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并与低温保存。2020/1/287C、热稳定性：热稳定性越高，工业化意义越大，热稳定性高，可以提高反应温度和反应速度，提高效率。D、对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶耐受力有所提高，可能的原因是由于空间位阻效应是蛋白酶不能进入固定化酶内部。2020/1/288⑶酶学特性的变化：A、底物专一性：对底物的专一性下降。B、最适pH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。C、最适温度：一般升高，原因是固定化后空间结构更为稳定。D、米氏常数（Km）：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。E、最大反应速度（Vm）：变化很小或不定。2020/1/289第三节酶的人工模拟一、模拟酶的概念人工模拟酶就是指根据酶的作用原理，用各种方法人为制造的具有酶性质的催化剂，简称人工酶或模拟酶。它们一般具有高效和高适应性的特点，在结构上比天然酶相对简单。2020/1/2810第三节酶的人工模拟二、模拟酶的理论基础稳定过渡态理论主客体化学和超分子化学2020/1/2811第三节酶的人工模拟二、模拟酶的理论基础稳定过渡态理论酶先与底物结合，进而选择性地稳定某一特定反应的过渡态（TS），降低反应活化能，从而加快反应速度。模拟酶要和酶异养能够在结合底物的过程中，通过底物的定向化、键的扭曲及变形来降低反应的活化能。2020/1/2812第三节酶的人工模拟二、模拟酶的理论基础主客体化学和超分子化学Cram把主体与客体通过配位键或其他次级键形成稳定复合物的化学领域称为主-客体化学。本质上，主-客体化学的基本意义来源于酶和底物的相互作用，体现为主体和客体在结合部位的空间及电子排列的互补。2020/1/2813第三节酶的人工模拟二、模拟酶的理论基础主客体化学和超分子化学超分子的形成源于底物和受体的结合，这种结合基于非共价键相互作用，如静电作用、氢键和范德华力等，当接受体与络合离子或分子结合成稳定的、具有稳定结构和性质的实体时，即形成了超分子。它兼具分子识别、催化和选择输出的功能。2020/1/2814第三节酶的人工模拟三、模拟酶的分类根据Kirby分类法单纯酶模型：以化学方法通过天然酶活性的模拟来重建和改造酶活性。机制酶模型：通过对酶作用机制诸如识别、结合和过渡态稳定化的认识，来指导酶模型的设计和合成单纯合成的酶样化合物：化学合成的具有酶样催化活性的简单分子。2020/1/2815第三节酶的人工模拟三、模拟酶的分类按照模拟酶的属性主-客体酶模型胶束酶模型肽酶抗体酶分子印迹酶模型半合成酶2020/1/2816第三节酶的人工模拟主-客体酶模型2020/1/2817第三节酶的人工模拟胶束酶模型模拟的胰凝乳蛋白酶侧链上接上羟基、咪唑基、羧基。2020/1/2818第三节酶的人工模拟分子印迹酶模型2020/1/2819第三节酶的人工模拟分子印迹酶的过程1、选定印迹分子和功能单位，让它们之间发生互补作用，形成印迹分子功能单位复合物。2、用交联剂在印迹分子功能单位复合物周围发生聚合反应，形成交联的聚合物。3、从聚合物中除去印迹分子，得到对印迹分子具有选择性的聚合物。2020/1/2820第三节酶的人工模拟分子印迹酶通过分子印迹技术可以产生类似于酶的活性中心的空腔，对底物产生有效的结合作用，并可以在结合部位的空腔内诱导产生催化基团，并与底物定向排列。性质：遵循米氏方程，催化活力依赖反应速度常数。2020/1/2821第四节酶的化学修饰天然酶的缺陷易于变性失活（酸、碱、有机溶剂、热）；容易受产物和抑制剂的抑制；工业反应要求的酸度和温度并不总是在酶反应的最适酸度和温度范围内；底物不溶于水，或酶的米式常数过高；酶做为药物在体内的半衰期较短等因素限制了酶制剂的应用。2020/1/2822第四节酶的化学修饰1.酶的化学修饰从广义上说，凡涉及共价键或部分共价键的形成或破坏的转变都可以看做是酶的化学修饰。从狭义上说，酶的化学修饰则是指在较温和的条件下，以可控制的方式使一种酶同某些化学试剂其特异反应，从而引起单个氨基酸残基或其功能基团发生共价的化学改变。2020/1/2823第四节酶的化学修饰2.酶的化学修饰的目的酶的化学修饰的目的在于：人为地改变天然酶的一些性质，创造天然酶所不具备的某些优良特性甚至创造出新的活性，来扩大酶的应用领域，促进生物技术的发展。①提高生物活性；②增强在不良环境中的稳定性；③针对异体反应，降低生物识别能力。2020/1/2824第四节酶的化学修饰3.酶的化学修饰的种类及应用酶的表面化学修饰酶分子的内部修饰2020/1/2825第四节酶的化学修饰酶的表面化学修饰大分子修饰（大分子结合修饰）目前应用最广的酶分子修饰方法。水溶性大分子通过共价键与酶分子表面结合，形成覆盖层。修饰剂：聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。如：PEG－超氧化物歧化酶（SOD）、PEG－溶血类蛋白质（链激酶、尿激酶等）、PEG－天门冬酰胺酶（ASNase）2020/1/2826第四节酶的化学修饰酶的表面化学修饰小分子修饰（酶蛋白侧链基团修饰）侧链基团：组成蛋白质氨基酸残基上的功能团。包括氨基、羧基、胍基、巯基、酚基、咪唑基。主要反应：烷基化反应、酰化反应、氧化还原反应、芳香环取代反应修饰剂：采用的各种小分子化合物，如2，4－二硝基氟苯、碘乙酸；乙酸酐、邻苯二酸酐；H2O2、2－巯基乙醇；四硝基甲烷、卤素。2020/1/2827第四节酶的化学修饰烷基化反应2020/1/2828第四节酶的化学修饰酰基化反应2020/1/2829第四节酶的化学修饰氧化还原反应连四硫酸盐氧化巯基，DTT还原逆回，用于保护巯基。2020/1/2830第四节酶的化学修饰芳香环取代反应碘代：I2＋+HI硝化：(NO2)4C++(NO2)3CH四硝基甲烷2020/1/2831第四节酶的化学修饰交联修饰（交联法）用双功能基团试剂(如戊二醛)，与酶分子内不同肽链部分共价交联，使酶分子空间构象更加稳定。2020/1/2832第四节酶的化学修饰固定化修饰（共价偶联法）通过酶表面的酸性或碱性残基，将酶共价连接到惰性载体上，由于酶所处的微环境发生改变，使酶的最适pH、最适温度和稳定性发生改变。2020/1/2833第四节酶的化学修饰酶分子内部修饰（一）蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）（二）氨基酸置换修饰（催化和非催化活性基团的修饰）（三）金属离子置换修饰（辅因子修饰）2020/1/2834第四节酶的化学修饰修饰酶的特性热稳定性提高抗各类失活因子的能力提高：蛋白酶、抑制剂、酸、碱、有机溶剂抗原性消除：免疫应答体内半衰期延长：药用疗效最适pH改变：接近生理环境酶学性质改变：Vm，Km，底物专一性对组织分布能力改变：靶器官2020/1/2835第五节酶工程的研究实例固定化青霉素酰化酶制备D-苯丙氨酸2020/1/2836第五节酶工程的研究实例OHONH2固定化青霉素酰化酶OHHNOO水溶液L-苯丙氨酸DL-苯丙氨酸COClNaOH溶液N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸OHHNOON-苯乙酰-D-苯丙氨酸OHONH2D-苯丙氨酸6mol/LHCl,120℃回流OHONH2DL-苯丙氨酸冰醋酸乙酸酐60℃3N盐酸回流2h2020/1/2837第五节酶工程的研究实例N-苯乙酰化反应：苯丙氨酸的N-苯乙酰化反应中，由于羧基和氨基都是活泼基团，如不加保护可能发生自身缩合反应，使合成产物复杂化，从而使产品不纯。如果在苯丙氨酸溶液中加入NaOH溶液，不仅可使苯丙氨酸的水溶性提高有利于反应的进行，而且苯丙氨酸在碱性条件下羧基带负电荷使羰基的活性大大降低，从而避免了苯丙氨酸的自身缩合反应。OCl+COOHNHONaOH溶液pH9~10,0~5℃NH2PhCOOH2020/1/2838第五节酶工程的研究实例N-苯乙酰化反应：实验证明此法合成N-苯乙酰化合物的纯度很高，几乎无副产物生成，而且苯乙酰化苯丙氨酸的水溶性很差，很容易从水溶液中提纯，收率高。在用固定化青霉素酰化酶手性拆分DL-苯丙氨酸中，将DL-苯丙氨酸先苯乙酰化生成N-苯乙酰-DL-苯丙氨酸。反应在pH：12-13的NaOH碱性条件下收率达74.3%。2020/1/2839第五节酶工程的研究实例N-苯乙酰-D-苯丙氨酸的水解和结晶：难点1：粗制的酰化物的产品纯度不高分析：产品中混有L-苯丙氨酸和盐解决方法:利用L-苯丙氨酸不溶于有机溶剂的物理特性,用乙醇溶解粗制酰化物，将不溶的L-苯丙氨酸和盐滤除,再旋蒸除去乙醇，得到精制的酰化物，由于将少量的L-苯丙氨酸和盐除去,从而提高了N-苯乙酰-D-苯丙氨酸产品纯度。2020/1/2840第五节酶工程的研究实例难点2：D-苯丙氨酸的提取困难分析：将N-苯乙酰-D-苯丙氨酸在6mol/L的盐酸溶液中回流水解完全后，由于后处理中加入NaOH溶液中和过量盐酸，从而使溶液体系中存在大量的盐，由于D-苯丙氨酸的水溶性很好，所以体系中存在的盐对提取D-苯丙氨酸产生很大的影响。D-苯丙氨酸的提取：2020/1/2841第五节酶工程的研究实例D-苯丙氨酸的提取：解决方法：作者采用阳离子交换树脂除去体系中的盐以确保产品的纯度，文中选用735＃阳