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SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential实验技能（一）纯化、薄层色谱SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential2第一部分实验技能•这部分针对保诺的实际情况介绍一些实用的实验技能，主要包括产品纯化、薄层色谱、柱层析、无水无氧操作、催化氢化和色谱分析六个部分。这部分内容是做ReferenceStandard项目的基础，应认真掌握。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential3§1-1产品纯化•当有机合成反应完成后，如何将产物从反应体系中分离出来就成了最重要的事情了，也就是说需要进行产品纯化，产品纯化是有机合成工作中非常重要的一环。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential4一、柱色谱•柱色谱的分离原理是利用混合物中各个成分的物理化学性质的差别，当选择某一个条件使各个成分流过支持剂或吸附剂时，各成分可由于其物理性质的不同而得到分离。•它可用于小量（和微量）的物质的分离、纯化处理。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential5二、重结晶•重结晶的原理是利用混合物中各组分在某种溶剂中的溶解度不同，而使它们互相分离。•它可用于固体物质（一般1克以上）的分离、纯化处理。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential6重结晶提纯法的一般过程为•选择适宜的溶剂；•将粗产品溶于适宜的热的溶液中制成饱和溶液；•乘热过滤除去不溶性杂质。如溶液的颜色深，则应先脱色，后过滤；•冷却溶液，使之慢慢析出结晶而杂质则留在母液中，或者杂质析出，而欲提纯的化合物则留在溶液中；•抽气过滤分离母液，分出结晶体或杂质；•洗涤结晶，除去附着的母液；•干燥结晶。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential7溶剂的选择•与被提纯的有机物不起化学反应，对被提纯的有机物应在热溶液中易溶，而在冷溶液中几乎不溶，如果杂质在热溶液中不溶的，宜乘热过滤去杂质，溶剂的沸点，不宜太低，也不宜过高。太低，溶解度改变不大；过高，附于晶体表面的溶剂不易除去。•常用的溶剂有苯、乙酸乙酯、石油醚、丙酮、乙醇等。•混合溶剂也经常被采用，如乙醇与水，乙醇与乙醚，乙醇与丙酮，石油醚与乙醚，苯与石油醚等。•溶剂的用量一般是溶质用量的10-30倍量。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential8晶体的析出过滤得到的滤液冷却后，晶体就会析出。用冷水或冰水迅速冷却并剧烈搅动溶液时，可得到颗粒很小的晶体，将热溶液在室温条件下静置使之缓缓冷却，则可得到均匀而较大的品体。如果溶液冷却后晶体仍不析出，可用玻璃棒摩擦液面下的容器壁，也可加入晶种，或进一步降低溶液温度(用冰水或其它冷冻溶液冷却)。如果溶液冷却后不析出晶体而得到油状物时，可重新加热，至形成澄清的热溶液后，任其自行冷却，并不断用玻璃棒搅拌溶液，摩擦器壁或投入晶种，以加速品体的析出。若仍有油状物开始析出，应立即剧烈搅拌使油滴分散。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential9三、蒸馏首先了解一些常用有机溶剂的沸点数据：二氯甲烷、丙酮、甲醇、苯、乙酸乙酯、乙醇、甲苯等SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential10蒸馏就是将液态物质加热到沸腾变为蒸气，又将蒸气冷凝为液体这个过程的联合操作。它可以分离液体混合物。2.减压蒸馏可分离或提纯沸点教高或性质比较不稳定的液态有机化合物。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential11四、萃取•萃取也是分离和提纯有机化合物常用的操作之一。•萃取的原理：设溶液由有机化合物X溶解于溶剂A而成，现如要从其中萃取X，可选择一种对X溶解度极好，而与溶剂A不相混溶和不起化学反应的溶剂B。•仪器的选择液体萃取最通常的仪器是分液漏斗，一般选择容积较被萃取液大1-2倍的分液漏斗．SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential14•萃取溶剂的选择根据被萃取化合物的溶解度而定，同时要易于和溶质分开，所以最好用低沸点溶剂。一般难溶于水的物质用石油醚等萃取；较易溶者，用乙醚萃取；易溶于水的物质用乙酸乙酯等萃取。每次使用萃取溶剂的体积一般是被萃取液体的1/5～1/3，两者的总体积不应超过分液漏斗总体积的2/3。•乳化现象解决的方法较长时间静置；若因碱性而产生乳化，可加入少量酸破坏或采用过滤方法除去若由于两种溶剂（水与有机溶剂）能部分互溶而发生乳化，可加入少量电解质（如氯化钠等），利用盐析作用加以破坏。另外，加入食盐，可增加水相的比重，有利于两相比重相差很小时的分离；SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential15§1-2薄层色谱•薄层色谱（TLC）是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术。最典型的在玻璃板上均匀铺上一薄层吸附剂，制成薄层板，用毛细管将样品溶液点在起点处，把此薄层板置于盛有溶剂的容器中，等溶液到达前沿后取出，晾干，喷以显色剂，测定色斑的位置。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential16一、吸附剂•一般常用的是：硅胶H/GF254（含荧光物质），这是一种含荧光物质的层析用硅胶，可在254nm的紫外光下观察荧光。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential18二、点样•在距薄层板（2x5cm,自制）下端5mm处，划一条线，作为起点线。用毛细管(內径0.3mm)吸取样品溶液（一般以乙酸乙酯、二氯甲烷等作溶剂，配成0.1%溶液），垂直地轻轻接触到薄层的起点线上。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential19三、展开剂的选择•极性小的及中等的一般采用石油醚和乙酸乙酯作展开剂，通过调整其配比，使Rf值调到0.3-0.6为佳。•极性大的一般采用二氯甲烷和甲醇作展开剂，通过调整其配比，使Rf值调到0.3-0.6为佳。•如上述系统不适合可尝试使用石油醚和丙酮、三氯甲烷和甲醇等展开体系。•酸或碱性物质由于在薄层板拖尾严重，所以分别在展开体系中加入0.1%乙酸或氨水。如反应物与生成物Rf值接近，可点交叉点加以区别。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential20化合物的吸附能力（亲和力）:化合物的吸附能力（亲和力）与分子极性有关。分子极性越强，其吸附能力也就越大。分子中所含极性较大的基团，其吸附能力也较强。通常吸附能力按下列排列次序递增：-Cl,-Br,-IC=C-OCH3CO2RC=O-CHO-SH-NH2-OH-CO2H色谱常用的洗脱剂及其洗脱能力（按次序递增）：己烷、石油醚＜环己烷＜四氯化碳＜二硫化碳＜甲苯＜苯＜二氯甲烷＜三氯甲烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜丙酮＜丙醇＜乙醇＜甲醇＜水＜吡啶＜乙酸。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential21四、显色剂•紫外灯：多环芳烃基团等•碘蒸气：很多有机物显黄棕色•茚三酮、浓硫酸等特殊显色剂SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential22柱层析•概述•层析柱的选择•吸附剂•洗脱剂•装柱•上样•洗脱分离•快速柱层析•反相硅胶板和反相硅胶柱SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential24一、概述柱层析，又叫柱色谱(ColumnChromatography)，通常在玻璃管中填入表面积很大、经过活化的多孔性或粉状固定吸附剂（如硅胶和氧化铝）。当待分离的混合物从柱顶加入，流经吸附剂（固定相）时就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入洗脱剂（流动相）。当洗脱剂流经吸附剂时，便发生了吸附和解吸过程，即混合物的各组分在固定相和流动相之间发生无数次的交换。由于各组分对吸附剂的吸附能力（或称亲和力）不同，便以不同的速度随流动相下移，形成若干色带。吸附能力最弱的组分随洗脱剂首先流出。分别收集各组分，进行逐个鉴定，从而达到分离纯化的目的。作为一种十分高效的分离提纯方法，柱色谱有着相当广的应用范围，适用于大量、少量甚至微量物质的分离。关键词：吸附和解吸、吸附能力、物理过程。SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential25二、层析柱.任何细颈玻璃管或带旋塞的滴定管均可用作层析柱。.专门定制各种尺寸规格的带有特氟珑旋塞和底部配备砂芯（以代替玻璃棉）的层析柱。.层析柱的选择。ColumnSize(ml)FractionSize(ml)SampleSize(g)200101~2400203~5600305~810005010200010020~304000150~200508000250~400100SpanningDrugDevelopment&theGlobeBioDuroConfidential27三、吸附剂常用的吸附剂有硅胶、氧化铝等，颗粒大小一般以通过200目左右筛孔为宜。颗粒太大，洗脱时溶剂推进太快，分离效果不好，反之如果颗粒太小，展开慢而造成拖尾不集中，分离效果也不好。1、硅胶硅胶一般分为硅胶G(掺入13%的粘合剂煅石膏)、硅胶H（不含粘合剂，层析用）和硅胶H/GF254（含荧光物质）。柱层析一般用比表面积300-400米2/克，颗粒度在300目以下的硅胶H做吸附剂。2、氧化铝色谱用氧化铝一般可分为酸性、中性和碱性三种。酸性氧化铝是用1