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第七章氨基糖苷类抗生素一、概述氨基糖氨基环醇苷键氨基糖苷类抗生素是由氨基环醇、氨基糖和糖组成的抗生素的总称。或氨基糖苷类抗生素是由一个或多个氨基糖分子和非糖部分的氨基环醇通过氧桥连接而成的苷类抗生素。氨基糖苷类：苷元+糖=苷碱性环醇氨基糖碱性苷特点：水溶性好、性质稳定、抗菌谱广、抗菌杀菌能力强、吸收排泄良好、不需作皮肤过敏试验、用药方便、与b-内酰胺类抗生素有协同作用等特点。天然氨基糖苷类分类阿米卡星、奈替米星异帕卡星、阿贝卡星来自链霉菌属来自小单胞菌属链霉素、卡那霉素新霉素、妥布霉素大观霉素庆大霉素、西索米星小诺米星、福提米星根据来源：半合成氨基糖苷类根据氨基环醇与氨基糖的种类与结合方式：1、链霉胍衍生物组：链霉素HNH2NNHHOHOOOHHNNH2HNCH3OHOOOHHNCH3HOHOHOOHC链霉素2、2-去氧链霉胺衍生物组：庆大霉素A、新霉素等3、其他氨基环醇衍生物组有效霉胺类型春日糖胺类型福提霉胺类型氨基糖苷类抗生素作用机理：抗菌机制为多环节抑制细菌蛋白质的合成：氨基苷类抗菌作用机制（上图为细菌正常蛋白质合成示意图，下图为氨基苷类药物作用示意图）正常细菌细胞药物导致错误编码5’3’mRNA氨基苷类处理的细菌细胞药物阻断起始复合物形成药物阻断移位药物阻断核糖体70S解离及肽链释放30S亚基-50S亚基5’3’mRNA起始密码子50S亚基新合成的肽链肽链释放30S亚基1、形态：无色，含水的无定形物质2、溶解性：多OH、NH2极性强、水溶性3、pH：脂肪氨基、胍显碱性药品为硫酸盐4、共轭体系：无紫外及红外特异吸收峰5、无明显熔点，相对分子质量小，具旋光性，易水解氨基糖苷类抗生素性质：OOHHOH2COHONHCH3OOHOHOHOOHCH3OHCNHNH2NHNHNH2NHCC临床应用的氨基糖苷类抗生素：1、抗结核杆菌作用：Streptomycin、Kanamycin2、抗脓绿杆菌活性：Gentamicin、Amikacin3、抗G+和G-，不抗结核杆菌和绿脓杆菌：Ribostamycin4、具有特定用途：Neomycin链霉素（Streptomycin）第一个用于临床的氨基糖苷类抗生素，亦是第一个抗结核药。1.抗菌谱：对结核杆菌、G-杆菌作用强，对铜绿假单胞菌无效2.耐药性：细菌对链霉素易产生耐药性3.临床应用：（1）兔热病、鼠疫——首选（2）结核病：+其他抗结核药（3）细菌性心内膜炎：+青霉素（4）布鲁菌病：+四环素4.不良反应：耳毒性最常见（前庭损害为主），其次为肌毒性过敏性休克，亦有肾毒性，已少用。庆大霉素（Gentamycin）临床最常用的氨基糖苷类抗生素1、对G-杆菌包括绿脓杆菌作用强，金葡菌有效，结核杆菌疗效差或无效；2、临床用于（1）一般G-杆菌感染——首选（2）绿脓杆菌感染：+羧苄（3）泌尿系手术前后预防感染，口服用于肠道感染及术前准备（4）局部用于皮肤、粘膜及五官的感染3、耳毒性以前庭损害为主，可逆性肾损害也多见卡那霉素（Kanamycin）•抗菌谱与链霉素相似，对结核杆菌有效，对绿脓杆菌无效•耳毒性、肾毒性大，仅次于新霉素，细菌易耐药•临床少用，可作为二线抗结核药阿米卡星（Amikacin，丁胺卡那霉素）•抗菌谱最广的氨基糖苷类，对结核、绿脓杆菌均有效；•对钝化酶稳定，不易产生耐药性•用于对常用氨基糖苷类耐药菌株的感染——首选其他氨基糖苷类抗生素妥布霉素对绿脓杆菌的作用较庆大强，且无交叉（Tobramycin）耐药；主要用于绿脓杆菌的严重感染。奈替米星对G+球菌的作用强于其他氨基糖苷类（Netilmicin）不易产生耐药性，与其他药物无交叉耐药耳毒性、肾毒性最小新霉素耳毒性、肾毒性最大（Neomycin）禁止全身使用，仅口服用于肠道感染、肠道手术前消毒及肝昏迷患者大观霉素对淋球菌高敏（Spectinomycin）用于耐青霉素菌株和对青霉素过敏的（淋必治）淋病患者二、链霉素的结构与理化性质链霉素属于含有链霉胍的氨基糖苷类抗生素族，由链霉胍、链霉糖、N-甲基-L-葡萄糖胺构成。CH2OH抗菌效能：链霉素≈双氢链霉素＞甘露糖链霉素（链霉素B）链霉素的效价标准系以1ug链霉素碱为1个单位。不同pH值下各种形式的链霉素平衡浓度010203040506070809010067891011121314pH值浓度/%链霉素的理化性质1、物理性质a、链霉素游离碱为白色粉末，无嗅，味微苦b、三个碱性基团→四种存在形式：23StrStr-H+StrStr-H+Str-H2+Str-H3+强碱性中性或酸性Str-H2+Str-H3+采用离子交换法提取链霉素的理化性质2、稳定性a、链霉素比较稳定，空气、光对干燥粉末影响不大b、链霉素游离碱或盐易吸湿而潮解→稳定性下降c、水溶液较稳定，受pH和温度影响较大最稳定pH为4.0~4.5稳定性随T↑而↓稳定性中性及偏酸性：双氢链霉素≈链霉素碱性条件下：双氢链霉素＞链霉素链霉素的理化性质3、溶解度a、多羟基、胺基→易溶于水、难溶于有机溶剂b、链霉素盐酸盐→易溶于甲醇，难溶于乙醇硫酸盐→难溶于有机溶剂4、旋光性链霉素盐都具有旋光性链霉素的理化性质5、链霉素盐类的性质a、磺酸、羧酸、磷酸酯链霉素盐类不溶于水，溶于有机溶剂溶剂萃取法提取或沉淀链霉素b、与某些盐类形成复盐→链霉素的精制链霉素盐酸盐链霉素盐酸盐-氯化钙复盐CaCl2甲醇溶液浓HCl阴离子交换树脂SO2-型4链霉素硫酸盐某些杂质、链霉素B、双氢链霉素等不能和氯化钙形成复盐链霉素的理化性质6、链霉素的降解反应—酸性条件连接链霉胍和链霉糖之间的苷键易断裂链霉素链霉胍+链霉二糖胺（弱碱）H+，H2O链霉素链霉胍+甲基链霉二糖胺苷二甲醇缩醛H+，CH3OH醛+甲基链霉二糖胺苷稀H2SO4浓H2SO4链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺△（强碱）坂口反应链霉素的理化性质6、链霉素的降解反应—碱性条件链霉素链霉二糖胺+链霉胍NaOH链霉糖+N-甲基-L-葡萄糖胺NaOH分子重排麦芽酚（FeCl3显紫色→测定链霉素效价）双氢链霉素无此反应链霉素/双氢链霉素橙红色硝普钠和铁氰化钾的碱性溶液Ba（OH）2链霉脲6NNaOH链霉胺胍基反应：链霉素的理化性质7、氧化和还原反应a、氧化反应—链霉糖醛基氧化成酸链霉素链霉素酸（无活性）Br2OH-b、还原反应—链霉糖醛基还原生成双氢链霉素直接还原法：催化剂、高压氢化电解还原法：电解阴极槽化学还原法：中性或弱碱性条件下，还原剂酸性条件下脱氧双氢链霉素链霉素的理化性质8、醛基反应Str-CHO+H2NRStr-CH=N-RStr-CHO+H2NR希夫碱链霉素OH-，H2OH+，H2O精制链霉素链霉素二链霉胺链霉素硫酸盐+氨OH-，H2OH+，H2ONH4+，NH3毒性较高纸层析分离法检测三、链霉素的发酵生产工艺一、生产菌种早期发现产链霉素的生产菌种是灰色链霉菌。后来：比基尼链霉菌、灰肉链霉菌等。多肽类抗生素、杀假丝菌素、放线酮高产菌株的获得：1、理化诱变2、高浓度链霉素逐步处理3、高浓度无机磷处理菌种退化外界培养和保存条件菌种自身的原因解决手段1、采用冷冻干燥法或砂土管法保存2、严格掌握保存条件3、严格控制传代次数4、定期进行纯化筛选，淘汰低单位菌落5、不断选育高单位新菌株，保证稳产高产链霉素的发酵工艺及控制要点1、斜面孢子培养链霉素生产采用三级或四级发酵培养，离子交换法分离精制产品。过程一般包括：斜面孢子培养→摇瓶培养→种子罐培养→发酵培养→提取精制砂土管→原始斜面→子斜面培养基葡萄糖蛋白胨→最关键的原料豌豆浸汁pH中性或偏酸性菌落形态：白色丰满的梅花形或馒头形链霉素的发酵工艺及控制要点2、摇瓶种子培养链霉素发酵经常使用摇瓶种子来接种种子罐。培养基黄豆饼粉葡萄糖→菌种的氨氮代谢和菌丝粘度硫酸铵碳酸钙3、种子罐扩大培养摇瓶种子二级种子三级种子10%10%严格控制罐温、DO、泡沫等发酵罐培养及控制要点1、发酵培养基培养基主要由G、黄豆饼粉、硫酸铵、玉米浆、磷酸盐和碳酸钙等所组成。碳源：G是链霉素发酵的最适碳源，10%以上氧传递速率：通气限制→G降解↑→乳酸和丙酮酸↑无机磷酸盐浓度：浓度↑→G利用率↑→抑制合成链霉素的发酵需要在高的氧传递水平和适当的低无机磷酸盐浓度下进行46.5~465mg/L发酵罐培养及控制要点1、发酵培养基氮源有机氮源：黄豆饼粉、玉米浆、酵母粉等无机氮源：硫酸铵、尿素、氨水等可溶性氮比不溶性氮易于利用，缩短周期氨基酸：有利于链霉素的生长和生物合成Glu、Asp→促进菌丝生长Pro、His、Arg→促进生物合成Gly、Ala→促进菌丝生长和生物合成无机盐离子：一般不需要添加，Fe2+浓度＜60mg/L发酵罐培养及控制要点2、链霉素培养条件及中间控制要点1、DO的影响及控制增加通气量提高发酵单位pH值升高蛋白质分解灰色链霉菌高度需氧提高搅拌速率提高发酵单位影响生长和单位增长过快链霉菌的临界氧浓度约为10-5mol/L注意：发酵前期泡沫较多，应避免长时间停止搅拌和闷罐2、温度的影响及控制灰色链霉菌对温度敏感，发酵温度以28.5℃为宜。3、pH的影响及控制菌丝生长：6.5~7.0pH链霉素合成：6.8~7.3低于6.0和高于7.5对链霉素的生物合成都不利pH自动控制系统4、中间补料控制碳源：G←根据耗糖速率→解除分解阻遏作用氮源：硫酸铵←pH值较高氨水←氨基氮和pH都较低四、链霉素的提取和精制链霉素的提取，目前均采用离子交换法。过程一般包括：发酵液的过滤→预处理→吸附→洗脱→精制→干燥以硫酸链霉素为例：发酵液原液饱和树脂洗脱液过滤吸附洗脱脱色、中和、精制粉针剂成品浓缩液精制液脱色、浓缩无菌过滤、干燥水针剂无菌过滤四、链霉素的提取和精制1、发酵液的过滤及预处理发酵液酸化液热液冷却液滤液原滤液草酸pH=3△2min冷却过滤NaOH原滤液质量标准：①外观澄明；②pH6.7～7.2；③温度10℃以下；④高价离子含量很少；⑤链霉素浓度为5000U／mL。高价离子在稀溶液中优先被吸附影响离子交换吸附保证链霉素不受破坏，又能使其和钠型羧酸基树脂全部解离四、链霉素的提取和精制2、吸附和解吸磺酸型树脂→亲和力太强，不易洗脱羧酸型树脂→很容易洗脱吸附：3RCOONa+Str3+（RCOO）3Str+3Na+pH6.7~7.2洗脱：（RCOO）3Str+3H+3RCOOH+Str3+H2SO4树脂的选择原则：交换容量高、选择性好、洗脱率高、机械强度膨胀度小→机械强度大→链霉素分子不能进入膨胀度大→树脂的选择性和机械强度降低X＋X＋X＋X＋X＋X＋Y＋X＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Z＋Y＋Y＋Y＋Z＋Z＋X＋Z＋Z＋X＋X＋X＋Y＋Z＋Y＋Z＋Ｘ＋Ｘ＋X＋X＋X＋X＋Ｚ＋X＋Ｚ＋X＋X＋OH－nX＋平衡上样吸附洗杂洗脱载体功能基团平衡离子四、链霉素的提取和精制2、吸附和解吸采用三罐或四罐串联吸附→防止链霉素损失主罐副罐次罐原滤液95%进口浓度饱和、解吸7%H2SO4低流速解吸脱色罐中和罐高浓度洗脱液低浓度洗脱液pH明显下降浓度降低解吸完全、树脂再生四、链霉素的提取和精制3、精制目的：除去与链霉素性质相近的一些毒性较大的阳离子杂质，如链霉胍、二链霉胺、杂质1号等。方法：1、采用高交联度树脂→除去小分子2、浓缩和活性炭脱色精制：精制液滤出液浓缩液H2SO4或NaOH调节pH4.0~4.5活性炭脱色35℃下真空浓缩H2SO4调节pH2.5活性炭酸性脱色液Ba（OH）2调节pH5.5~6.0活性炭成品浓缩液无菌过滤喷雾干燥粉针剂柠檬酸钠亚硫酸钠无菌过滤水针剂除去热原质