实验九 玻璃器皿的清洗包扎、培养基的制备及灭菌

实验九玻璃器皿的清洗包扎，培养基的配制及灭菌一、目的要求1、明确培养基的配制原理。2、通过对牛肉膏蛋白胨培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤。3、了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围4、了解干热灭菌的原理和应用范围。5、了解紫外线灭菌的原理和方法。6、玻璃器皿的清洗包扎要熟练操作。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，有时又称为普通培养基。它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在沸水浴中或下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温的不同而有所不同。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。牛肉膏蛋白胨培养基的配方如下：牛肉膏3g蛋白胨10gNaCl5g琼脂15～20g水1000mlpH7．4～7．6干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，波长为200—300nm的紫外线都有杀菌能力，其中以260nm的杀菌力最强。为了加强紫外线灭菌效果，在打开紫外线灯以前，可在无菌室内（或接种箱内）喷洒3—5％的石炭酸溶液，一方面使空气中附着有微生物的尘埃降落，另一方面也可以杀死一部分细菌。超净工作台内紫外灯（线）灭菌三、器材牛肉膏，蛋白胨，NaCl，琼脂；1mol/LNaOH，1mol/LHCl；试管，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，培养基分装器，扭力天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸（pH5．5～9．0），棉花，牛皮纸，记号笔，麻绳，纱布等。培养皿，试管，吸管，电烘箱等。牛肉膏蛋白胨培养基，培养皿（6套一包），手提式高压蒸汽菌锅等。紫外线灯，3～5％石炭酸或2～3％来苏尔溶液，牛肉膏蛋白胨平板。四、操作步骤一、称量准确、迅速，一种药品一把药勺，勿盖错药瓶盖二、溶化水的加法、加热搅拌三、调pH忌调过头后来回调培养基的制备四、过滤五、分装1、液体分装：试管高度的1/4左右三角瓶容积的1/22、固体分装：试管高度的1/5左右（制斜面）半固体：1/3左右（垂直穿刺）马丁氏培养基——定容；瓶口棉塞培养基的制备六、加塞七、包扎八、灭菌一般15磅（121℃）20分钟九、摆斜面温度、斜面长度（试管的1/2）十、无菌检查37℃培养24—48小时常用培养基一、牛肉膏蛋白胨培养基应用最广泛的细菌基础培养基。配方：牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000mlpH7.4-7.6常用培养基二、高氏Ⅰ号培养基用于培养、观察放线菌形态特征；加入适量的抗菌物质（抗生素、酚）用于分离放线菌（选择性培养基）。常用培养基高氏Ⅰ号培养基配方：可溶性淀粉20g按配方顺序依次溶解否则NaCl0.5g产生沉淀KNO31.0gK2HPO4.3H2O0.5g抗生素现用现加,温度不宜MgSO4.7H2O0.5g过高否则易分解FeSO4.7H2O0.01g琼脂15-25g水1000mlpH7.4-7.6常用培养基三、马丁氏培养基用于分离真菌的选择性培养基配方：KH2PO41.0g另加孟加拉红和链霉素MgSO4.7H2O0.5g抑制细菌、放线菌生长蛋白胨5g葡萄糖10g琼脂10-20g水1000mlpH自然试管分装摆斜面摆斜面实物图五、实验报告结果检查培养基灭菌是否彻底。试管清洁如何，培养基制备的合不合理。玻璃器皿的清洗器皿包扎器皿包扎六、思考题（1）培养微生物的培养基应具备哪些条件？为什么？（2）在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？图Ⅴ—5通气塞A．配制时纱布塞法；B．灭菌时包牛皮纸；C．培养时纱布翻出（3）培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的？（4）干热灭菌完毕后，在什么情况下才能开箱取物？为什么？（5）高压蒸汽灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降到0时才能打开排气阀，开盖取物？紫外线杀菌的原理是什么？全自动高压蒸汽灭菌锅