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我国虫草属真菌研究开发的现状报告人：曹珊2008.11.171虫草无性型的分离与确证2虫草生物学、生理学及遗传育种研究3虫草资源的应用价值评估4对今后研究开发的思考1虫草无性型的分离与确证目前,全球已发现的虫草属菌种有400多种,我国已报道的有100种左右。虫草属真菌具有抗肿瘤、抗病原、抗氧化、增强人体免疫功能等多种生理活性。迄今为止,虫草属真菌在药理作用、有效成分和人工培养等方面的应用研究取得了一定的进展。近年来,国内外人工培养虫草,特别是冬虫夏草已成为一个热点问题。人工培养虫草面临的首要问题就是菌种(虫草无性型)的分离。但是,在这样多的冬虫夏草菌种中,哪一种是真正的无性型?如何正确确定虫草的无性型,这不仅是冬虫夏草开发中的现实问题,也是要不要把虫草作为一类可再生的生物资源来研究和利用的关键。1.1多途径多批次分离确定此法简便易行,能及时分离到很易失去生存力的虫草菌种,是随后确证虫草无性型研究工作的基础。但此法难以排除获得的是互生、伴生、混合感染和重寄生菌等非真正虫草无性型菌株的可能性。故需要用其它方法对获得的假定无性型作进一步确证。1.2微循环产孢直接确证在特定条件下，真菌的孢子(有性或无性孢子)萌发后无营养菌丝生长阶段(或仅有极少量的菌丝生长)就直接重复产孢的现象称为微循环产孢(Microcycleconidiation)。大多数虫草子囊孢子在一定条件下都能直接萌发进行微循环产孢，形成具有鉴别特征的无性产孢结构。在采集虫草标本时，将诱发子囊孢子微循环产孢并与同时进行的多途径多批次分离培养的菌株产孢结构相比较，就可快速、直观、可靠地确定一种虫草的无性型。1.3在特定人工培养基上诱发虫草有性子实体的确定将组织和子囊孢子分离所得的培养物进行人工培养诱发出有性型子实体，而后经切片观察,确定与野外采集标本有性产孢结构的同一性，以确证分离培养物为其无性型。此法最具权威性，但有不少虫草种目前很难人工培养出子实体。1.4现代分子生物学技术应用RAPD-PCR的分子生物学的方法可以为确定虫草的无性型提供可靠的分子生物学证据。其程序是首先分别提取虫草子座和假定无性型的DNA,再筛选出合适的引物进行PCR扩增,得到相应的基因组DNA指纹图谱；如果两者的指纹图谱相似率很高（在90%以上）,就可确定分离获得的假定无性型是实际的无性型。此外,用保守的引物ITS1,ITS4对rDNA的区域进行PCR扩增,产物经纯化后,对ITS进行测序,比较两者碱基序列的相似性,也可确定虫草的无性型。2虫草生物学、生理学及遗传育种研究2.1虫草子囊孢子的阶段发育虫草种主要以子囊上部、子囊孢子和次生子囊孢子的形状及大小等微观特征进行鉴别。而某一鉴定者描述鉴定的某一种虫草,都只是反映了该种虫草一个特定的生长发育阶段的特征。因而,同一种虫草不同生长发育阶段的标本,完全可能被不同的真菌学工作者鉴定为不同的虫草。冬虫夏草子囊孢子发育过程中,在原子囊孢子期、子囊孢子伸长期和子囊孢子成熟期三个阶段,它们在形态特征和大小上存在明显的差别。因此,对虫草种的鉴定,很有必要从子囊孢子发育的动态过程,全面认识和掌握子囊孢子的形状和大小这一微观的鉴别特征。在实际鉴定工作中,应以诱导发射的子囊孢子作为形态、大小的描述和测定的依据。2.2多型现象与分类鉴定和应用研究密切相关的另一重要基础问题是虫草无性型的形态、生理和遗传上的多样性。研究发现,蛹虫草无性型蛹草拟青霉(P.militaris)在单孢子株水平上的菌落特征、基质菌丝形态、产孢结构、有性子实体形成能力、nit突变株的类型、营养亲和性分群、核相变化以及常温下存活时间等形态、生理和遗传特性方面都有较大的差异。因此判明，出现在蛹虫草无性型中的几个同物异名,完全是不同研究者对蛹虫草无性型多型现象不同产孢结构特征的观察结果。观察、研究、分析虫草无性型多型现象,对正确确定虫草的真正无性型具有重要的指导意义。这对其他相似半知菌的正确分类鉴定也有参考价值。2.3虫草人工培养虫草真菌具有很大的药用价值，因此虫草人工培养对虫草类真菌的科学研究和生产应用具有重要意义。由于人工培育冬虫夏草子实体难度大，许多单位和人员在虫草的菌丝体研究做了大量的工作。人工培养的虫草菌丝体的大多成分、理化性质及药理作用与冬虫夏草相似，在国内已有许多菌丝体制剂进行了大规模的生产，并取得了好的经济效益。而且，由于菌丝体人工培养简单、产量高，作为天然冬虫夏草的代用品，开发应用潜力还很大。2.4原生质体制备及杂交育种原生质体融合(Protoplastfusion)技术起源于20世纪60年代。1979年匈牙利的Pesti首先报道融合育种提高青霉素产量,原生质体融合技术成为改良工业菌株的手段之一。在微生物育种研究中，国内外学者进行了大量的研究，试图通过细胞原生质体融合、转化来实现基因重组，以及通过诱变技术来获得高产菌株和多功能菌株。作为一个优良的实验系统，原生质体已经在微生物及相关的不少领域得到应用,并取得了可喜的成绩。3虫草资源的应用价值评估虫草资源开发应用的总趋势是从层次上升和面的展开两个方向发展。在我国,传统作为药用的虫草有冬虫夏草、蝉花〔C.sobolifera(Hill)Berk.〕和大团囊虫草〔C.ophioglossoides(Ehrenb.)Link〕三种。近年来,对从冬虫夏草中分离到的中华头孢、中国拟青霉、蝙蝠峨拟青霉、蝙蝠蛾被孢霉、中华束丝孢、中国弯颈霉和中华被毛孢等真菌,结合生产开发,对它们的药理和药化研究都有一些报道。与此同时,对其它一些虫草的应用价值也作了研究。这些研究工作的内容多集中于比较不同虫草资源的组成与冬虫夏草的化学组成,如氨基酸、甘露醇、甾醇、腺苷及微量元素的相似程度上,其目的是判明它们能否作为冬虫夏草的代用品。研究结果表明,这些虫草所测化学成分与冬虫夏草的基本相同,在药理作用上也基本一致,它们有望成为冬虫夏草的代用品。特别值得一提的是,近年来,国外将冬虫夏草和蛹虫草作为功能食品开发,倍受人们青睐,现已有数十种产品投放市场。国内一些研究单位对除冬虫夏草外的其它虫草资源的新用途和新组分也开展了一些有意义的研究工作。4对今后研究开发的思考虫草不仅是传统意义上的药用真菌和虫生真菌,虫草研究工作不仅是标本的采集、描述和鉴定,更应关注无性型菌种的分离、确证、鉴定、培养、保存和利用,这对充分发挥这类资源真菌的价值将十分有意义。探讨用分子生物学技术快速测定虫草不同个体发育阶段及虫草有性型和无性型的遗传同一性,在虫草分类中具有明显的针对性。虫草的形态分类应建立在子囊孢子的个体发育、相关无性型确证及其产孢结构的多型性和DNA分子分类的新的基础上。低分子类次生代谢产物在医药、其他生物技术中的应用和生物防治中的潜力应引起人们更大的关注。微生物次生代谢产物的应用绝不仅限于抗生素,从真菌中寻找非抗菌素的酶抑制剂、受体抑制剂和激活剂,免疫调节剂等低分子代谢产物,已成为十分受人关注的热点。现代虫草分类学已涉及到菌物的个体发育、多型现象、DNA多态性和微循环产孢等生物学现象及其它不完全菌类的分类知识。次生代谢产物的开发利用,不仅要了解药物和其它精细化工产品的研究开发动态,从菌物学的角度,更应研究掌握这类真菌的阶段分化和组织建成与次生代谢产物形成的质和量上的时序关系;在深层发酵条件下形成内菌核的可能性和条件;以及生物技术育种等问题。谢谢！