第十一章 基因工程和基因组学

浙江大学遗传学第十一章1转基因烟草荧火虫荧光素酶第十一章基因工程和基因组学浙江大学遗传学第十一章21．基因工程和基因组学的概念和应用；2．内切酶的类别和作用；3．重组DNA；4．基因的分离和鉴定；5．基因组图谱的构建和应用；6．后基因组学。本章重点浙江大学遗传学第十一章3果蝇转基因–半乳糖苷酶第一节基因工程浙江大学遗传学第十一章4广义遗传工程：生化工程、蛋白质工程、细胞工程、染色体工程、细胞器工程、基因工程及酶工程等。狭义遗传工程：基因工程（重组DNA技术）。一、基因工程概述:浙江大学遗传学第十一章5１.概念：基因工程：在分子水平上，采取工程建设方式按照预先设计的蓝图借助于实验室技术将某种生物的基因或基因组转移到另一生物中去使后者定向获得新遗传性状的一门技术。基因工程技术的建立，使实验生物学领域产生巨大变革。浙江大学遗传学第十一章62．内容：①．从细胞和组织中分离DNA；②．限制性内切酶酶切DNA分子，制备DNA片段；③．将酶切DNA分子与载体DNA连接构建能在宿主细胞内自我复制的重组DNA分子；④．把重组DNA分子引入宿主受体细胞复制；⑤．重组DNA随宿主细胞的分裂而分配到子细胞建立无性繁殖系（clone）或发育成个体；⑥．从细胞群体中选出所需要的无性繁殖系并使外源基因在受体细胞中正常表达，翻译成蛋白质等基因产物、回收；或筛选出获得定向性状变异的个体。浙江大学遗传学第十一章73.发展：1971年史密斯（SmithH.O.）等人从细菌中分离出的一种限制性酶酶切病毒DNA分子，标志着DNA重组时代的开始。1972年伯格（BergP.）等用限制性酶分别酶切猿猴病毒和噬菌体DNA，将两种DNA分子用连接酶连接起来得到新的DNA分子。1973年科恩（CohenS.）等进一步将酶切DNA分子与质粒DNA连接起来，并将重组质粒转入E.cloi细胞中。浙江大学遗传学第十一章81982年美国食品卫生和医药管理局批准，用基因工程在细菌中生产人的胰岛素投放市场。1983年转基因烟草和马铃薯获得成功。1994年延熟保鲜的转基因番茄商品生产。1997年克隆羊“多莉”诞生（苏格兰科学家利用6岁成年母羊乳腺细胞）。浙江大学遗传学第十一章91998年美国夏威夷大学用一只实验鼠的细胞克隆了3代共50只实验鼠。2000年美国用无性繁殖技术克隆猴子“泰特拉”，意味克隆人体已无技术障碍。2001年美国宣布首次克隆成功处于早期阶段的人体胚胎。2002年法国研究者宣布克隆出第一个女婴，但一直未获得证实。浙江大学遗传学第十一章102002年美国克隆体细胞克隆猫。2003年意大利克隆成功克隆马“普罗梅泰亚”（世界上首次由哺乳动物生下自己的克隆体，是母女、姐妹关系）。2003年12月美国德州农业机械大学宣布克隆成功白尾鹿。2005年韩国克隆狗斯努皮Snuppy。浙江大学遗传学第十一章112007年中国克隆哥廷根小型猪。2009年西班牙克隆布卡多野山羊（2000年绝种），绝种前用液氮冷冻保存耳朵皮肤细胞在近亲动物的帮助下，可能可以复活已灭绝的猛犸和袋狼等珍稀物种。浙江大学遗传学第十一章12转基因技术近年来发展迅速：1983年世界首例转基因烟草培育成功（Calgene公司），标志着人类利用转基因技术改良农作物的开始；1986年5种转基因材料进入田间试验；1994年美国批准耐储藏转基因番茄进入市场；现已有许多转基因产品被批准在生产上使用。全世界转基因作物总面积170110027803990442052605870677081009000102001143012500020004000600080001000012000140001996199719981999200020012002200320042005200620072008万公顷从1996年至2008年的累计种植面积超过8亿公顷1996年全世界转基因植物种植面积为170万ha，1997年为1100万ha，1998年2780万ha，1999年3990万ha，2000年4420万ha，2001年5260万ha，2005年9000万ha，2008年1.2亿ha。浙江大学遗传学第十一章155.9占Canola总面积的20%15.5占Cotton总面积的46%65.8占Soybean总面积的70%37.3占Maize总面积的24%SoybeanMaizeCottonCanola2008年全世界主要转基因作物的种植面积和比例（百万公顷）浙江大学遗传学第十一章16HerbicideTolerantInsectResistance(Bt)StackedGenes2008年全世界不同性状转基因作物的种植面积（百万公顷）79.0（63%）19.1（15%）26.9（22%）浙江大学遗传学第十一章172007年：美国（5770万hm2，53%）、阿根廷、巴西、加拿大、印度、中国（390万hm2）、巴拉圭、南非、乌拉圭、菲律宾、澳大利亚、罗马尼亚、墨西哥、西班牙、哥伦比亚、法国、伊朗、洪都拉斯、捷克共和国、葡萄牙、德国、斯洛伐克等23个国家近1030万农户种植了转基因植物全球1.143亿hm2（占全球15亿hm2的8%）。美国、阿根廷、巴西、加拿大4国的转基因种植面积占全球的90%以上。浙江大学遗传学第十一章18各国转基因作物种植面积比较62.52115.87.67.63.82.71.80.2010203040506070USAArgentinaBrazilCanadaIndiaChinaParaguaySouthAfricaAustralia百万公顷1996199719981999200020012002200320042005200620072008浙江大学遗传学第十一章19浙江大学遗传学第十一章20涉及转基因性状：抗除草剂：主要为转基因大豆、玉米、棉花、油菜，5860万hm2，约占全世界转基因作物的72%；抗虫：主要为转基因玉米、棉花，1560万hm2，占19%；抗除草剂抗虫：主要为转基因玉米、棉花680万hm2，占9%；其它：抗病毒、抗细菌、抗真菌、抗逆境、品质改良以及生长发育的调控、提高产量等。浙江大学遗传学第十一章212009年种植面积1.2亿公顷的转基因作物：大豆：占种植面积的75%，均为抗除草剂大豆；玉米：占种植面积的26%，抗虫、抗除草剂；棉花：占种植面积的20%，抗虫、抗除草剂；油菜：占种植面积的15%，抗除草剂；其它：水稻、小麦、花生、向日葵、亚麻、甘蓝、马铃薯、番茄、烟草、南瓜、木瓜、番木瓜、草坪草等。主要分布:美国、巴西、阿根廷、加拿大、印度、中国、澳大利亚等。浙江大学遗传学第十一章22至2008年，我国已经批准商业化种植的产品有25种，其中1种转基因大豆、8种转基因玉米、1种转基因番茄、7种转基因油菜、2种转基因棉花，以及改变花色矮牵牛、抗病毒甜椒等转基因植物。转基因棉花已大规模种植。2009年，转基因水稻和玉米已批准商业化生产。浙江大学遗传学第十一章231.限制性内切酶（restrictionenzyme）：一种水解DNA的磷酸二脂酶，遗传工程中重要工具。细菌细胞中存在限制修饰系统：限制：降解外源DNA，防御异源遗传信息进入的手段。修饰：修饰外源DNA片段后，保留在新细胞中。二、限制性内切核酸酶：浙江大学遗传学第十一章24限制性内切酶如：EcoRI、HindIII：酶切方式：以交错方式切断DNA双链，产生二个相同单链粘性末端。重组过程：两种片段在适宜条件下，可经磷酸二脂链，连接成重组DNA分子。浙江大学遗传学第十一章25⑵．限制性内切酶的类别：第Ⅰ类酶（切割部位无特异性）：如EcoB（大肠杆菌B株）、EcoK（大肠杆菌K株）分子量较大（约300000），作用时需ATP、Mg++等辅助因子。第Ⅱ类酶（切割部位有特异性）：如EcoRI（大肠杆菌）、HindⅢ（嗜血杆菌），分子量较小（约20000~100000），作用时需Mg++存在。⑴．限制性内切酶的命名：根据其来自的生物名称，用英文字母和数字表示；①.EcoRI来自大肠杆菌（Escherichiacoli）；②.HindⅢ来自嗜血杆菌（Haemophilusinfluenzae）。浙江大学遗传学第十一章26第Ⅱ类酶特点：切割产生平齐末端（bluntends），如SmaI：浙江大学遗传学第十一章27有的产生粘性末端（stickyends），如BamHI、PstI、EcoRI、HindⅢ：识别特定碱基顺序，如回文对称序列（palindrome，又称反向重复序列，从两个方向阅读其序列相同的序列）。浙江大学遗传学第十一章28部分常用的限制性内切酶浙江大学遗传学第十一章29将“目的”基因导入受体细胞的运载工具。DNA片段适合的载体DNA重组DNA在载体DNA的运载下，进入宿主细胞，并在其中复制。DNA载体：质粒、噬菌体、病毒、细菌或酵母菌人工染色体等。三、载体（vector）：浙江大学遗传学第十一章30载体的条件：①.具有复制原点，能自我复制；②.具多克隆位点（multiplecloningsite，MCS或polylinkerregion），即有多种限制酶的切点；③.选择时的遗传标记，如抗生素基因；④.易从宿主细胞中回收。pUC19质粒浙江大学遗传学第十一章31㈠、细菌质粒：质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子。质粒具有重组表型检测标记，检测是否携带外源DNA片段。在细胞内的复制程度：严紧型：一个细菌细胞内质粒数量有1~2个；松驰型：每个细胞内有20~60个。浙江大学遗传学第十一章32如pUC18具有以下特点：①.分子量小，可接受较大外源片段；②.拷贝数多，500个／细胞；③.克隆位点的酶切位点多，克隆方便；④.具有用于检测重组质粒的选择标记（–互补的显色表型）。浙江大学遗传学第十一章33㈡、λ噬菌体（温和型）：基因组全长为49kb。噬菌体DNA中间约2/3的序列为中间基因簇，两端为DNA左、右臂。中间基因簇可被外源DNA替代而不影响侵染细菌能力。能接受15kb外源DNA片段作为cDNA或核DNA克隆载体。优点：不易引起生物危害，有助于“目的”基因进入细胞并增殖；携带大片段外源DNA分子，占总量25%时仍不失活。浙江大学遗传学第十一章34㈢、柯斯质粒（cosmid）：噬菌体DNA部分细菌质粒DNA序列柯斯质粒。有噬菌体cos序列、细菌质粒复制原点、抗生素抗性标记。这种质粒分子量较小，但可接受长达50kb的外源DNA片段克隆真核生物基因。∵一个长片段DNA可能具有真核生物基因的编码序列及其它调控序列。浙江大学遗传学第十一章35指能在两种不同生物中复制的载体。如能在原核生物（如E.coli）、真核细胞（如酵母）中复制的载体。穿梭载体需具有细菌质粒复制原点、真核生物自主复制序列（Auto-nomouslyreplicatingsequence,ARS）以及两者的选择标记。穿梭载体在细菌中用于克隆、扩增基因，在酵母中用于基因表达分析。酵母菌的YEP（yeastepisomaplasmid）等系列载体均是穿梭载体。㈣、穿梭载体（shuttlevector）：浙江大学遗传学第十一章36㈤、细菌人工染色体（bacterialartificialchromosome，BAC）：BAC载体一般可携带大于50kb的外源DNA片段。F因子改造成BAC载体，甚至可用于克隆100kb以上的DNA片段。特点：带有外源DNA的BAC载体在细胞中是单拷贝的；载体分子量很小（7.4kb）；选择标记：氯霉素抗性基因；多克隆位点。浙江大学遗传学第十一章37㈥、酵母人工染色体（yeastartificialchromosome，YAC）：1996年完成了酵母菌全基因组序列的测定。YAC具有自主复制序列、克隆位点和可在细菌和酵母菌中选择的标记基因；还具有酵母菌染色体一些特点；可接受100~1000kb的外源DNA片段。YAC已成为人类基因组计划和图位克隆基因的重要工具；并促进了人类人工染色体