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第二节基因工程的步骤1、基因工程的基本工具（1）“分子手术刀”---。①来源：主要是从生物中分离纯化出来的②功能：能够识别双链DNA分子的某种的序列，并且切割特定的两个脱氧核苷酸之间的断裂，形成黏性末端。2、“分子缝合针”-----。①功能：缝合两个脱氧核苷酸之间的。②与DNA聚合酶作用的异同：。3、“分子运输车”----。最常用的载体是：。必须具备的条件：4、目的基因的获取方法：。5、将目的基因导入植物细胞，最常用的方法是，其次还有和。受体细胞可以是受精卵、体细胞（经组织培养成为完整个体）。将目的基因导入动物细胞：最常用的方法是。此方法的受体细胞多是。复习回顾如图为DNA分子的切割和连接过程：（1）EcoRl是一种酶，其识别序列是，切割点是与之间的键。切割结果产生的DNA片段末端形式为。（2）不同来源DNA片段结合，在这里需要的酶应是连接酶，此酶是通过在与之间形成键，而起“缝合”作用的。限制酶GAATTC鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌吟脱氧核苷酸磷酸二酯键黏性末端DNA鸟嘌呤脱氧核苷酸腺嘌吟脱氧核苷酸磷酸二酯键通过DNA重组技术使原有基因得以改造的动物称为转基因动物。运用这一技术使羊奶中含有人体蛋白质，下图表示了这一技术的基本过程，在该工程中所用的基因“剪刀”能识别的序列和切点是一G↓GATCC一，请回答：（1）从羊染色体中“剪下羊蛋白质基因的酶是。人体蛋白质基因“插入”后连接在羊体细胞染色体中时需要的酶是。（2）请画出质粒被切割形成黏性末端的过程图。（3）人体蛋白质基因之所以能“插入”到羊的染色体内，原因是，“插入”时常用的工具是。限制性内切酶DNA连接酶用限制酶切割—CCTAG﹐G——GGATCC——CCTAGG—有互补的碱基序列细菌质粒或病毒32P标记的DNA分子探针杂交放射自显影法DNA杂交直接鉴定基因工程的一般程序一、目的基因的获得二、重组载体的构建三、重组载体的导入和筛选四、目的基因的表达与鉴定一、目的基因的获得直接分离法（最常用的方法——鸟枪法）人工合成法化学合成法反转录法法外源DNADNA片段目的基因多个目的基因信使RNADNA单链双链DNA多个目的基因多个目的基因蛋白质氨基酸序列目的基因核苷酸序列目的基因二、重组载体的构建基因表达载体的组成：b、目的基因a、启动子c、终止子d、标记基因e、复制原点提醒①与载体相比较,增加启动子、目的基因和终止子三个基因片段,其功能各不相同。②启动子(DNA片段)≠起始密码子(RNA);终止子(DNA片段)≠终止密码子(RNA)。三、重组载体的导入和筛选细胞类型常用方法受体细胞转化过程植物细胞农杆菌转化法体细胞将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上动物细胞显微注射技术受精卵将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培养→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物微生物细胞Ca2+处理增大细胞壁通透性原核细胞或酵母菌用Ca2+处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸收提醒①唯一不涉及到碱基互补配对的操作步骤。②微生物做受体细胞主要是个体微小,代谢旺盛,繁殖速度快,获得目的基因产物多。③植物细胞还可用基因枪法和花粉管通道法。基因表达基因表达指基因组中某基因在细胞中转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变预示着细胞在分子水平上的变化。它往往是细胞形态功能变化之前的变化。DNARNAProtein转录翻译四、目的基因的表达和检测检测1.1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。(1)此图表示的是采取__________合成基因的方法获取__________基因的过程。(2)图中①DNA是以_________为模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。(3)图中③代表，它往往含基因，以便对目的基因的检测。人工目的信使RNA重组DNA分子标记2、下图为利用生物技术获得动物乳腺反应器和抗虫棉的过程，据图回答：⑴在基因工程中，A表示，如果直接从苏云金杆菌中获得抗虫基因，①过程使用的酶区别于其他酶的特点是，B表示。⑵在研究过程中，研究人员首先从相关基因组中获取了目的基因，并采用技术对目的基因进行了扩增，然后将目的基因与质粒等载体组合形成了重组载体。在重组载体的构建过程中需要的工具酶有。目的基因识别特定的核苷酸序列，并且在特定的位点上切割DNA分子重组DNAPCR限制性内切酶、DNA连接酶⑶基因表达载体的构建是基因工程的核心，一个完整的基因表达载体至少包括哪些部分?。⑷将目的基因导入受体细胞的过程中，在③过程中一般是采用方法，在②过程中一般采用方法，受体细胞一般是。⑸由于转基因表达产物存在于山羊的乳汁中，检测其体内是否出现药用蛋白，在分子水平上的检测方法及结果是什么?。⑹要确定目的的基因（抗虫基因）导入棉花细胞后，是否能稳定遗传并表达，需进行检测和鉴定工作，请写出在个体水平上的鉴定过程：。目的基因、启动子、终止子、标记基因等部分农杆菌转化法显微注射技术受精卵进行抗原—抗体杂交如果出现杂交带，表明奶牛中出现了抗原蛋白；不出现杂交带，表明奶牛中未出现抗原蛋白让害虫吞食棉花叶，观察害虫是否具有抗虫性状3.为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。⑴获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制性内切酶作用于图中的处，DNA连接酶作用于处。（填“a”或“b”）⑵将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和法。（3）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的做探针进行分子杂交检测，又要用方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性aa基因枪法（花粉管通道法）耐盐基因（目的基因）一定浓度的盐水浇灌（移植到盐碱地中）