反转录提前终止

快速扩增cDNA末端——RACERACE的基本概念不同厂家RACE试剂盒的介绍RACE技术的关键环节存在的问题及解决办法RACE的基本概念cDNA末端快速扩增(rapidamplificationofcDNAends,RACE)技术是基于PCR技术由已知的部分cDNA序列来获得完整cDNA序列的一种方法，为Frohman在1985年首次报道。3’RACE和5’RACE3’RACE原理示意图mRNA(A)n5’GSP3’5’3’CC…CCGSP2GI…IG5’AAPAUAPnestedGSP3’CC…CC5’GI…IG5’3’3’AUAPnestedGSP5’3’5’(A)n5’不同厂家RACE试剂盒的介绍InvitrogenGeneRacerTMKitBDSMARTTMRACERACE技术的关键环节RACE技术的关键环节有2个：1.3个连续的酶促反应（逆转录、TdT加尾、PCR扩增）TdT加尾反应是用脱氧核糖核酸末端转移酶（TDT）催化，它可将dT依次加在寡核苷酸的3’端2.RACE的引物即使3个酶促反应均平稳顺利进行，但结果也通常会出现一些非特异性产物或非全长的产物背景。存在的问题及解决办法反转录1.RNA的质量有高质量的不被核糖核酸酶降解的RNA，RNA的完整性至关重要。一旦RNA降解就要重新提取，免得后期工作没有结果既浪费时间又浪费试剂，给试验带来麻烦。2.反转录提前终止模板中有特殊的二级结构，反转录提前终止。通过提高反转录的温度，加大反转录的反应体系以及反转录过程中一直保持已变性的RNA模板处于50℃以上，避免以解开二级结构的RNA再恢复原来的结构，以达到5’末端。提供一种改进的反转录方法1.在RNase-free的0.2mLEppendorf管中加入以下成分：2.Oligo(dT)(0.5μg)1μLTotalRNA(4~5μg)3μLDEPC-H2OTo25μL混匀，70℃保温10min；50℃保温5min；稍微离心一下。3.在混合物中，依次加入以下成份：4.10XSSⅡ（SSⅢ）Buffer5.0μL10mMdNTPmix1.0μL0.1MDTT2.0μLRNaseInhibitor(40U/μL)1.0μLDEPC-H2OTo24μL轻轻混合，在50℃保温5min后，在50℃下将3号管中的混合成分移入2号管中。5.每个反应加入1μLSuperScriptTMⅡ（SSⅢ），轻轻混匀，50℃反应50min。6.70℃放置15min以终止反应。7.-20℃保存。TdT加尾反应及其替代反应首先在反转录后，一些无用的核苷酸和过多的cDNA引物的存在会干涉加尾的成功，降低目的cDNA加尾的有效性，从而导致第二链cDNA合成效率的降低。其次，TdT反应难以控制，所有的cDNA都被加尾，而不管是否是全长cDNA，这样产生的非全长的cDNA将和全长产物一起完成PCR反应，而且会优先扩增，不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。TdT加尾反应及其替代反应第三，若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区，则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始，产生非全长的第二条cDNA链。我们所使用Invitron公司的RACE试剂盒，采用PCR介导的连接反应，在一定程度上避免了以上的问题。RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾，这样在反转录合成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行，会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序，用TdT酶加上多聚T尾，结果降低了反转录的难度，两个基因最终均获得了完整的5’末端。RACE引物的设计在实验过程中总结如下经验：1.引物不能设计在保守区简并引物区。2.各引物之间尽量不要重叠，由于引物的重叠，会引起很严重的引物多联体现象，不能准确地扩增。3.尽量多设计引物，以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物，便于鉴定的正确性。PCR扩增及产物的克隆PCR扩增存在的问题一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定的、不需要的产物，有时甚至没有目的产物；另一方面，可能根本就没有扩增到任何产物。增加PCR扩增效率，提高扩增产物的特异性解决方法：1.热启动PCR(hotstartPCR)，长距离PCR(longdistancePCR)和降落PCR(touch－downPCR)以及加大反应体系中Mg2+的浓度提高扩增效率。2.利用抑制PCR(suppressionPCR)技术改进RACE程序，可大大减少非特异性的线性化扩增。3.单引物的线性扩增问题：坚持做单引物对照，并减少引物的浓度。M123M45M6789M：2000marker；1：5GSP11+NAP；2：NAP；3：GSP11；4：5GSP22+AUAP；5,7,9：AUAP；6,8：5GSP44+AUAP图多轮PCR扩增的电泳结果Fig.ResultsofPCRamplifiedABM12M34M56CA：ThefirstPCR；BC：NestPCRM：2000marker；1：5GSP11+NAP；2：NAP；3：5GSP332+AUAP；4,6：AUAP；5：5GSP333+AUAP图多轮PCR扩增的电泳结果Fig.ResultsofPCRamplifiedM123456MM：2000marker；1：3GSP441+AUAP；3：3552+AUAP；5：3IPCR2+AUAP2,4,6：AUAP；图多轮PCR扩增的电泳结果Fig.ResultsofPCRamplified图5’RACE、3’RACE克隆的片段与GsAP2序列拼接的结果Fig.Thecontigresultof5’RACE、3’RACEandGsAP2bysoftware