搜索
分子克隆工具酶——限制性酶的反应系统限制性内切酶同其他酶类一样，反应系统应包括酶、底物和反应缓冲液，并且还需要合适的温度。1限制性酶的反应系统1.1底物DNA限制酶的底物是dsDNA分子（或其片段），作用位点在识别序列上。1.1.1DNA样品纯度在样品中，若含有蛋白质，或没有去干净制备过程中所用的乙醇、EDTA、SDS、酚、氯仿等，均会降低限制酶的催化活性，甚至酶不起作用。1限制性酶的反应系统1.1.2DNA分子构型限制酶切割线性分子的效率明显高于切割超螺旋质粒DNA和环状病毒DNA的效率。1限制性酶的反应系统1.1.3识别序列的侧面序列大多数限制酶对只含识别序列的寡核苷酸是不具有催化活性的。例：EcoRIGAATTC解决方法：在识别序列两侧加适当碱基。GGAATTCC只有加适当碱基，才能达到正常的切割效率。1限制性酶的反应系统1.1.3识别序列的侧面序列在PCR引物设计时，若在PCR产物末端有某种限制酶的识别序列，则处于末端的识别序列的一侧应该有一个或几个“保护”核苷酸。SphI5’GCATCCAAGGATCCGAC3’5’GGGCATCCAAGGATCCGAC3’1限制性酶的反应系统1.1.3识别序列的侧面序列特例：SalI和SpeI等限制酶的识别序列两侧不加“保护”核苷酸，同样可以被识别和切割。1限制性酶的反应系统1.2位点偏爱(sitepreferences)某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率。不仅侧面序列长短与限制酶的切割效率有关，而且侧面序列的核苷酸组成与切割效率也有关。在pBR322中，NaeI有4个识别序列，位置分布在：403、771、931和1285处。一般情况下，403和771可迅速被NaeI切割，931稍微慢些，而位于1285处的识别序列，切割效率只有其他的1/15.1限制性酶的反应系统1.3DNA甲基化限制酶作用：降解外源DNA，从而阻止其复制和整合到细胞中。甲基化酶作用：对自身某个碱基进行甲基化，从而保护自身DNA不被降解。一旦在识别序列中的核苷酸被甲基化，就会影响酶切的效率。1限制性酶的反应系统1.4反应缓冲液反应缓冲液中应含有氯化镁或醋酸镁、氯化钠或醋酸钾、二硫苏糖醇（DTT)或巯基乙醇、Tris（三羟甲基氨基甲烷）—HCL或Tris—Ac.1.4.1PH值7.0—7.91.4.2Mg2+酶活性中心，由氯化镁提供1.4.3DTT提供一定的还原能力，促进连接反应有效进行。1.4.4BSA（小牛血清清蛋白）稳定剂，有些酶在低浓度下不稳定或活性低，加入BSA后提高活力。1限制性酶的反应系统1.5反应温度一般是37℃•一方面是温度升高,酶促反应速度加快。•另一方面,温度升高,酶的高级结构将发生变化或变性，导致酶活性降低甚至丧失。•因此大多数酶都有一个最适温度。在最适温度条件下,反应速度最大。102030405060708090020406080100TemperatureOCRelativeActivity(%)最适温度1限制性酶的反应系统1.6反应时间一般为1h或更多。许多酶延长反应时间，可以减少酶的用量。例：EcoRI若反应时间为16h，则所用酶量为只酶切1h的1/8.1限制性酶的反应系统1.7酶量反应系统中酶量取决于酶本身的催化活性和底物DNA样品。1.7.1酶活性1.7.2底物DNA限制酶有效作用的不是DNA分子的全序列，而是其中特定的识别序列。1限制性酶的反应系统1.8staractivity限制酶识别和切割特异性位点是在特定的条件下进行的，当条件改变时，许多酶的识别位点会改变，导致识别与切割序列的非特异性。原因：甘油浓度高酶过量离子强度低加有机溶剂（DMSO）用别的二价离子一般用Mg2+Zn2+PH不适合解决措施：》》》》》》》》具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件aAvaI1,2,4BamHI1-5,8BstI2,4BsuI2,4,6EcoRI1,2,4-6HaeⅢ2,4HhaI2,4,7HindⅢ6HpaI1,2,4PstI1,2,4,7PvuⅡ2,4SalI1,2,4,7ScaI4-6,8SstⅡ2,4XbaI2,4,7a.1：亚乙二醇(45%)；2:甘油(12%)；3：乙醇(12%)；4：高酶/DNA比(25U/μg)；5：Mn++代替Mg++；6:pH8.5;7:二甲基亚砜(8%);8:无NaCl。思考题：影响限制酶反应的因子有哪些？