2-2柠檬酸发酵工艺-zy

第一章柠檬酸发酵工艺学三、黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏方法1、斜面低温保藏法2、载体吸附保藏法3、真空冷冻干燥保藏法4、液氮超低温（-196℃）保藏法是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵蔗糖，产物以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接近中性时则大量产生草酸，而柠檬酸产量很低。2.1概述2.2黑曲霉柠檬酸生产菌的选育及保藏2.3柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺2.4柠檬酸的提取和精制2.5柠檬酸的质量标准及新工艺新技术2.3柠檬酸发酵机制及深层发酵工艺条件第一节柠檬酸发酵机制一、柠檬酸生物合成途径1、黑曲霉柠檬酸生物合成途径葡萄糖经EMP、HMP途径降解生成丙酮酸，丙酮酸一方面氧化脱羧生成乙酰CoA，一方面经CO2固定化反应生成草酰乙酸，草酰乙酸与乙酰CoA缩合生成柠檬酸。糖酵解途径葡萄糖6-磷酸葡萄糖6-磷酸果糖1,6-二磷酸果糖磷酸二羟丙酮+3-磷酸甘油醛磷酸二羟丙酮3-磷酸甘油醛1,3-二磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸+ATP3-磷酸甘油酸2-磷酸甘油酸磷酸烯醇式丙酮酸丙酮酸+ATP激酶——凡是催化磷酰基键ATP分子转移到受体上的酶，都称为激酶HMP途径6-磷酸葡萄糖5-磷酸核酮糖5-磷酸核糖+5-磷酸木酮糖6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛磷酸-D-赤藓糖+5-磷酸木酮糖6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛①EMP途径在黑曲霉柠檬酸生产菌中起重要作用。②研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环的酶系，证明黑曲霉中存在三羧酸循环。③研究证实，CO2固定反应对柠檬酸积累具有重要的生理意义。④黑曲霉CO2固定中，存在两个CO2固定系统丙酮酸——→草酰乙酸Keq=0.818磷酸烯醇式丙酮酸——→草酰乙酸，Keq=0.049可见，黑曲霉柠檬酸生产菌中CO2固定反应主要是丙酮酸羧化酶催化的，黑曲霉中已提纯出此酶。柠檬酸生物合成途径三羧酸循环概要2、酵母柠檬酸生物合成途径解脂假丝酵母能利用烷烃、乙醇、乙酸发酵生成柠檬酸。酵母（烷烃）柠檬酸生物合成途径异柠檬酸裂解酶切割异柠檬酸产生乙醛酸和琥珀酸乙醛酸经苹果酸合成酶催化，在水的存在下接受乙酰辅酶A的乙酸，生成苹果酸。NAD+:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（氧化态）NADH:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（还原态）NADP+:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（氧化态）NADPH:烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（还原态）NAD++H++2e-=NADHNADP++H++2e-=NADPH辅酶，用来实现电子传递二、黑曲霉柠檬酸发酵的代谢控制1、黑曲霉柠檬酸积累的代谢调节第一个调节酶是磷酸果糖激酶（PFK酶）柠檬酸、ATP对该酶有抑制作用：↑生产菌需要解除该抑制AMP、无机磷、NH4+对该酶有活化作用↓实验表明，NH4+能有效的解除柠檬酸、ATP对该酶的抑制作用因此，生产上添加铵盐来增加柠檬酸产量Mn2+的影响：Mn2+缺乏→菌体TCA酶活下降Mn2+缺乏→可能干扰蛋白质合成，导致蛋白质分解↓减少柠檬酸对该酶的抑制←NH4+水平升高第二个调节点：CO2固定的酶活力高，保证草酰乙酸的供应研究证实，柠檬酸的生成速度与CO2固定量有化学计量关系，CO2固定主要是丙酮酸羧化酶催化的，生成了草酰乙酸。第三个调节点：TCA环上的调节柠檬酸合成酶，是一种调节酶，但在黑曲霉中没有调节作用顺乌头酸水合酶、异柠檬酸酶pH2.0时，失活阻断TCA循环柠檬酸合成酶活性很高时积累柠檬酸顺乌头酸水合酶需要Fe2+在发酵液中添加黄血盐，络合Fe2+阻断TCA循环，积累柠檬酸黑曲霉除正常呼吸链（产生ATP）之外，还存在一条侧呼吸链（不产生ATP）缺氧对侧呼吸链的损伤是不可逆的，因才在产酸阶段，一定要保证足够的溶氧供应。三、黑曲霉柠檬酸的发酵机制归纳由于严格限制供给锰离子，筛选出耐高浓度金属离子的菌株，使细胞中形成高水平的铵离子，从而解除了柠檬酸和ATP对PFK酶的反馈抑制，使EMP途径的代谢流增大。存在一条呼吸性强的侧系呼吸链，不产生ATP，缺氧则呼吸链失活，细胞内ATP浓度下降，减轻了ATP对PFK酶的抑制，促使EMP途径的畅通，增加柠檬酸的生物合成。丙酮酸羧化酶是组成性酶，不受代谢调节控制，可源源不断地提供草酰乙酸，丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和草酰乙酸的供给，柠檬酸合成酶又基本上不受调节或极微弱，增强了柠檬酸的合成能力。α-酮戊二酸脱氢酶受葡萄糖（蔗糖）和铵离子阻遏，使黑曲霉中的TCA循环变成“马蹄形”的代谢方式，减弱TCA循环，降低细胞内ATP浓度，另外使α-酮戊二酸浓度升高，又反馈抑制异柠檬酸脱氢酶，降低柠檬酸的自身分解。顺乌头酸水合酶催化时建立柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸：=90：3：7的平衡，顺乌头酸水合酶的作用总是趋向于合成柠檬酸，即柠檬酸分解活力低。一旦柠檬酸浓度升高到某一水平，就抑制异柠檬酸脱氢酶的活力，从而进一步促使柠檬酸的自身积累，pH降至2.0以下，顺乌头酸水合酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累并排出体外。柠檬酸食用小贴士常饮酸牛奶：酸奶中含有的乳酸及其它一些有机酸如柠檬酸、葡配合酸等，其稀释液还具有明显的杀菌和防腐作用，被誉为粘膜组织的“清洗剂”，它有助于软化皮肤的粘性表层，去掉死去的旧细胞，在此过程中，皱纹也随之消除了。吃水果减肥，是不少女性最喜欢使用的方法之一。每100克柠檬中只含24卡路里热量。柠檬中的柠檬酸能促进热量代谢，而且它的维生素C含量是水果中的佼佼者，美白效果好，热量又低，爱美想瘦的女性可适量食用，但避免空腹吃。其它如荔枝，桔子，葡萄等都是富含柠檬酸的佳品。白癫风患者不能服用含柠檬酸一类的酸的东西。第二节柠檬酸发酵原料工业上考虑因素：经济、技术、货源、易得、易运、易贮、易管、不易霉变、可利用物质含量高、综合利用价值高、无毒、无害、无抑制微生物生长的物质、对产品卫生安全可靠、三废负荷少。1、糖类薯类：甘薯、木薯、马铃薯、甘薯干、木薯干、马铃薯干、薯渣谷类：玉米、小麦或小麦面粉、大米淀粉：各种谷类、薯类等加工成的淀粉砂糖：白砂糖、赤砂糖、糖蜜淀粉糖：由淀粉水解得到的各种单糖、双糖、糊精、饴糖、葡萄糖母液2、正烷烃液体石蜡：10~20碳链的石油馏出物3、其他果实下脚料：葡萄、菠萝、柑橘、苹果等果实加工的残渣、残汁粮食加工下脚料第三节柠檬酸深层发酵工艺为延长黑曲霉作用时间，采用二次发酵工艺第一次固体发酵培养基→接种黑曲霉（30℃静止培养3d）→第一次发酵→→加适量麸皮、尿素及等量酱渣→接种白地霉、酵母菌（30℃静止培养）→第二次发酵。柠檬酸深层发酵工艺流程深层发酵生产柠檬酸的主体设备是发酵罐。微生物在这个密闭容器内繁殖与发酵。现多采用通用发酵罐。它的主要部件：罐体、搅拌器、冷却装置、空气分布装置、消泡器，轴封及其他附属装置。发酵罐径高比例一般是1:2.5，应能承受一定的压力,并有良好的密封性。培养基制备：（1）种子罐培养基及培养：甘薯干粉16～20%，(NH4)2SO40.5%，0.1MPa蒸汽灭菌30min，接入1000ml三角瓶麸曲菌种，35±1℃培养16～24小时，发酵罐的接种量为10%。（2）发酵培养基：甘薯干粉16～20%，0.1%中温α-淀粉酶115℃灭菌10～15min，玉米粉采用高温α-淀粉酶二次喷射液化，液化后过滤除渣，应控制并调配其发酵培养基中蛋白质含量为0.2～0.4%一、营养要求根据柠檬酸发酵机制，黑曲霉能够大量积累柠檬酸的条件，提供高浓度的葡萄糖和充足的氧，对磷、锰、铁、锌等无机盐物质处于低水平。1、碳源：葡萄糖、蔗糖、糊精为了降低成本，工业上：甘薯、玉米、小麦及其淀粉、糖蜜等。高糖浓度是柠檬酸发酵的一大特征：薯干粉的深层发酵，粉浆浓度16%~20%，淀粉质深层发酵，粉浆浓度达25%2、氮源（合成细胞质和调节代谢）生理酸性氮(NH4)2SO4,(NH4)3PO4,(NH4)2HPO4,NH4Cl,(NH4)2CO3等，调节代谢，控制pH生理碱性氮NaNO3,KNO3,LiNO3,Ca(NO3)2,Mg(NO3)2等两性氮NH4NO3有机氮麸皮，米糠，蛋白胨，氨基酸，尿素等玉米原料特点1、玉米淀粉2、玉米蛋白质玉米粉的蛋白质含量较高，达9.3%，属于醇溶朊、谷朊、球朊等。其中醇溶朊是玉米蛋白质的主要成分，它占玉米蛋白质总量的40%，加热后凝固。玉米蛋白质对柠檬酸发酵具有双重作用：一是节省柠檬酸发酵所需氮源；二是与戊聚糖、色素等胶体杂质一起影响后道发酵及提取收率。因此，原料预处理过程中通过中和、过滤去除这部分杂质对柠檬酸生产的后道发酵、提取是必要的。3、玉米中脂肪3、无机盐在柠檬酸发酵中，无机盐有的构成菌体，有的促进代谢，有的促进产酸，对黑曲霉的生长和柠檬酸发酵有重要作用黑曲霉对无机盐和微量元素的要求要求KH2PO4或K2HPO4含量/%KCl含量/%MgSO4·7H2O含量/%Zn2+含量/(mg/L)Mn2+含量/(mg/L)Cu2+含量/(mg/L)S含量/(mg/L)Fe2+含量/(mg/L)深层发酵0.05~0.50.01~0.030.01~0.05＜0.3＜0.2＜0.5＜0.07＜2二、温度控制黑曲霉属嗜热微生物，最适生长温度33~37℃28℃长菌和产酸缓慢，温度过低则发酵时间延长。37℃菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸一般控制在（35±1）℃孢子发芽和菌球体形成阶段，可采用40℃高温培养，促进其发育三、pH控制适宜pH3~7。在发酵过程中，原料糖化和产酸过程在同一个环境中，发酵技术的关键是要保证糖化速度和产酸速度之间的衔接与平衡。黑曲霉柠檬酸生产菌的酸性糖化酶最适pH4.0~4.6柠檬酸发酵最适pH2.0以下解决办法：①采用酸性平板驯化，分离在高柠檬酸浓度下糖化酶活力高的菌株；②通过调节风量来控制，在16~18h前控制低风量，使pH维持在有利于菌株生长和糖化作用的范围。1、最适温度的选择在生长阶段，应选择最适生长温度；在产物分泌阶段，应选择最适生产温度。发酵温度可根据不同菌种、不同产品进行选择2、温度的控制工业生产上，所用的大发酵罐在发酵过程中一般不需要加热，因发酵中释放了大量的发酵热，需要冷却的情况较多。利用自动控制或手动调整的阀门，将冷却水通入发酵罐的夹层，通过热交换来降温，保持恒温发酵。如果气温较高（特别是我国南方的夏季气温），冷却水的温度又高，致使冷却效果很差，达不到预定的温度，就可采用冷冻盐水进行循环式降温，以迅速降到最适温度。因此大工厂需要建立冷冻站，提高冷却能力，以保证在正常温度下进行发酵。二、发酵温度为35±1℃三、pH值控制（1）pH值对发酵的影响影响酶的活性，当pH值抑制菌体中某些酶的活性时，会阻碍菌体的新陈代谢；影响微生物细胞膜所带电荷的状态，改变细胞膜的通透性，影响微生物对营养物的吸收和代谢产物的排泄；影响培养基中某些组分的解离，进而影响微生物对这些成分的吸收；pH值不同，往往引起菌体代谢过程的不同，使代谢产物的质量和比例发生改变。（2）发酵过程pH值的变化在发酵过程中，随着菌种对培养基碳、氮源的利用，随着有机酸和氨基酸的积累，会使pH值产生一定的变化。①生长阶段：菌体产生蛋白酶,水解培养基中的蛋白质，生成NH4+，使pH上升至碱性；随着菌体量增多，NH4+的消耗也增多，另外糖利用过程中有机酸的积累使pH值下降。②生产阶段：这个阶段pH值趋于稳定。③自溶阶段：随着养分的耗尽，菌体趋于自溶而代谢活动终止，菌体内活跃的蛋白酶和氨基氮进入培养液中，致使pH又上升。pH值培养时间培养过程中培养液pH值的大致变化趋势由此可见，在适合于菌生长及合成产物的环境条件下，菌体本身具有一定的调节pH的能力，但是当外界条件变化过于剧烈，菌体就失去了调节能力，培养液的pH就会波动。（3）引起发酵液pH值异常波动的因素pH值的变化决定于所用的菌种、培养基的成分和培养条件