生物分离工程(三版)(孙彦)09

生物分离工程电泳和电色谱技术学习总体要求掌握电泳概念，电泳速度及凝胶电泳，了解其他几种常见电泳原理及特点，操作及应用。电泳及电泳分离电泳电泳是荷电溶质（电解质）在电场作用下发生定向泳动的现象。电泳分离利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法，称为电泳分离。电泳分类根据电泳原理分类区带电泳；等电点电泳（等电聚焦）；等速电泳；根据电泳载体分类凝胶电泳；自由流电泳；电色谱电泳与色谱原理相结合可以派生多种复合分离方法电泳色谱(electrophoreticchromatography)将溶质的电泳迁移与色谱分离相结合电色谱(electrochromatography)利用电渗作为驱动流动相流动，分离作用源于溶质在固定相和流动相间的分配平衡特性基础理论识记：电泳、迁移率、电渗流概念理解：了解自由溶液中的电泳速度和凝胶中的电泳速度电解质在电场中运动＋－阴离子阳离子自由溶液中电泳速度荷电溶质在电场中所受的静电引力f与溶质的荷电荷数z及电场强度E成正比，其表示为荷电溶质在自由溶液中受到的阻力f’为当两者之间达到平衡后，fEZe'6efrv'ff06eeZEvuEr电解质溶质迁移率真实电泳速度在实际过程中，根据双电层理论，荷电溶质的表面附近存在距表面由高到低的反离子分布。当荷电溶质的表面电位（φ0）很小时，电位沿表面附近半径方向的变化可用如下的指数函数表示，0xe12132210BkTeNI真实电泳速度考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率变为1r061eZfrurr1r1.5fr1fr204reZu06eZur凝胶浓度的表示法电泳分离中常用的聚丙烯酰胺凝胶是由丙稀酰胺单体和交联剂N,N’-甲叉双丙稀酰胺在催化剂和引发剂的作用下共聚调制，凝胶浓度可用如下公式表示%100mbaTg100%gbcab凝胶浓度：交联浓度：－丙烯酰胺单体质量；－交联剂单体质量；－缓冲液质量；abm凝胶中的电泳速度当一定交联浓度时，聚丙稀酰胺凝胶中电泳迁移速率和凝胶浓度之间有如下关系grTKuu0loglog为与交联剂浓度有关的凝胶延迟系数；为外插到Tg＝0时的迁移率；rK0u电渗流速度电渗流是荷电固体表面诱导的双电层中反离子在电场作用下发生定向迁移引起的。电渗流可用下式表示：0wLEv+-凝胶电泳－学习要点理解：凝胶电泳原理，等速电泳的原理特点，以及分离操作和分离特性凝胶电泳－定义凝胶电泳是利用凝胶分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离的电泳分离方法。凝胶电泳原理原理在凝胶电泳过程中，不同分子量的荷电溶质在迁移过程中的泳动速度是不同的。相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作用较大，泳动速度慢；相反，分子量小的溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含不同溶质的区带，实现溶质间的分离。凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液中溶质的相对分子量而异。凝胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一。不连续凝胶电泳形式不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成。上层凝胶浓度在2-3%Tg，其凝胶孔径很大，凝胶对溶质的泳动基本上无阻滞作用，表现为等速泳动，溶质在此层得到浓缩；下层凝胶浓度在5-25%Tg，凝胶具有一定的孔径，各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。因此，上层称为浓缩层或浓缩胶；下层称为分离层或分离胶。等速电泳的原理在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离子（一般为强电解质离子，Cl-）；迁移率最小的阴离子为末尾离子（一般为甘氨酸）；电泳开始前，将含有目标蛋白质的料液加入到前导离子和末尾离子之间；料液区的pH值高于前导离子区的pH值；在前导离子区，前导离子的浓度与反离子的浓度一定时，由于pH值不变，其泳动速度为一定值；末尾离子根据其处位置的pH值所产生的解离度和离子迁移率将向阳极（带负电荷）或阴极（带正电荷）移动；等速电泳的原理(续)料液中移动速度最快的组分A（pH高）首先进入前导离子区，但由于前导离子区pH值较低，溶质的解离度减小（所带负电荷变少，pH降低），泳动速度减慢。因此，其被排挤出前导离子区，从而在前导离子区和混合料液区交界处组分浓度增加；同时，为了与反离子保持电中性，该处溶液pH值降低；在此降低的pH值下，其它组分不能与组分A以相同的速度泳动而拖后；随着时间的推移，所有的溶质都开始形成独自的区带，显示与该区带内的弱酸离子和反离子浓度相应的pH值。等速电泳的特点各个组分间形成相互连接的独自区带，显示各自与对离子相应的pH值；提高前导离子的浓度可以使溶质得到浓缩；采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作间隔物，可使目标蛋白与其它蛋白质完全分离；不连续凝胶的分离操作不连续凝胶层的上部和下部分别使用pH值不同的缓冲液，其中上部缓冲液根据待分离蛋白质等电点选定。上层浓缩层采用pH6.8的缓冲液，下层分离层采用pH8.3的缓冲液；上层中，料液中蛋白质夹在前导离子和末尾离子之间在浓缩层内等速泳动，达到等速电泳状态后进入下层分离凝胶；下层中蛋白质受到高浓度凝胶的分子筛作用，末尾离子会超过蛋白质，蛋白质依据荷电量和分子大小分离；影响不连续凝胶分离的因素缓冲液的pH值、组成调节pH值可以改变荷电量Z；分离胶的浓度或交联度调节凝胶浓度可改变迁移率；外加电压等电点聚焦－学习要点理解：等电点聚焦的原理及特点等电点聚焦定义等电聚焦是利用蛋白质和氨基酸等两性电解质具有等电点，在等电点的pH值下蛋白质呈电中性，不发生泳动的特点进行电泳分离的方法。形成连续梯度的化合物IEF的关键是调配稳定的连续pH值梯度，一般采用氨基酸混合物或氨基聚合羧酸，其带有许多正负电荷，这类物质具有与蛋白质相近似的等电点范围，缓冲能力强，pH值梯度稳定。其结构如下在无外加电场作用时，作为载体的两性电解质溶液的pH值大约是该溶液pH值范围的平均值。稳定pH梯度的形成在电场作用下，组成溶液的无机盐电解质（如硫酸钠等）在阳极聚焦硫酸而在阴极聚焦氢氧化钠。如果此时有载体存在于溶液中，则它们在阳极的酸性介质中就会得到质子而带正电，在阴极的碱性介质中则失掉质子而带负电。这样载体就会受其附近的电极所排斥而向相反方向移动。设其中有一个酸性最强的两性电解质A（pI值最小），当它由阴极逐渐接近阳极的硫酸时，就会失去电荷而停止运动。由于它有高的缓冲能力，使环境溶液的pH值等于A的等电点，A所在的位置就是它的等电点，另有一个等电点稍高于两性电解质A的物质B，当向阳极运动靠近A时，它不能超过A，因为那里低于它的等电点。于是B将带正电荷而向阴极移动，它只能排在A的阴极侧。IEF原理蛋白质在电场作用下泳动到等于各自等电点的pH值区域形成具有不同等电点的蛋白质区带；IEF特点受溶质扩散影响小，IEF可消除分子扩散引起的分离度下降。两性电解质的加入对产品产生污染；pH梯度稳定性不高；操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象；二维电泳－学习要点理解：上述电泳原理和特点应用：了解上述电泳技术的适用范围二维电泳－定义二维电泳是同时利用分子的大小和等电点这两种特性的差别进行蛋白质等生物大分子的电泳分离方法。二维电泳原理在凝胶电泳槽的y方向上具有浓度分布，而在x方向上首先调配pH值梯度，使溶质分子以等电点聚焦的形式泳动到其等电点处。然后将适当pH值的缓冲液渗透到凝胶中，在y方向上加电场使溶质再次泳动。此时溶质之间的泳动速度受荷电量及分子量的影响，直至泳动到被高浓度凝胶所阻滞，相互之间得到进一步分离。二维电泳＝凝胶电泳＋等电点聚焦二维电泳特点分离度高，可分离等电点相差0.01个pH值的蛋白质；处理量小，适用于分离微量的高纯度目标产物，用于科学研究；逆向作用层析电泳－学习要点理解：逆向作用层析电泳原理和特点应用：了解逆向作用层析电泳技术的适用范围逆向作用层析电泳原理逆向作用层析电泳是利用填充两层具有不同排阻极限的凝胶过滤介质的层析柱为电泳场，并使溶质的电泳速度与流动相的流向相反。上层凝胶的排阻极限小（孔径小），下层凝胶的排阻极限大。由于在上层凝胶介质中溶质的分配系数小于下层凝胶介质，故溶质在上层凝胶柱中的层析速率（vF,T）大于下层凝胶柱的层析速率（vF,B）。而在外加电场情况下，溶质在两层凝胶中的电泳速度（vE）相同。如果调整外加电场满足如下条件,,FTEFBvvv逆向作用层析电泳原理目标溶质在上层凝胶柱中的净迁移速度与其在下层凝胶中的净迁移速度相反；当vF,T=-vF,B时，目标溶质在两层凝胶柱交界处所受作用力达到动态平衡，从而积聚在界面处，产生界面聚焦现象，实现目标溶质的的浓缩；而其它溶质不能在此界面浓缩逆向作用层析电泳特点容量大；分辨率高；高电压操作；散热困难；