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PILOTSTUDY俞锦锋南昌大学转化医学研究院DEFINITION中试研究就是将生物技术产品从实验室阶段向生产阶段过渡的一个中间阶段，目的是建立一条完全模拟生产实际状况的小型质控和生产流水线，是对中试规模的一系列参数和条件进行研究的过程。这里的参数包括使用的发酵条件、复性、纯化方案的选择，纯化色谱流动相的配方、浓度、流速及洗脱程序、制剂的配方等，另一个很重要的部分包括质控方法和质控体系的研究，通过中试研究能够在生产条件下生产稳定可靠的产品，一般需要研制部门生产连续3—5批产品以考察中试条件的稳定性。PROBLEM目前国内研究单位对中试研究的理解往往忽略了质控体系的建立，因为没有完善合理可行的质控体系，就无法对中试研究产品的质量做出准确的判别质控体系的建立应贯穿在整个中试研究的过程中。另一个经常出现的问题是中试规模偏小，研制部门为了节约时间，在申报阶段往往是为了获得一定量的用于申报的样品，他们更注重产品的质量而不考虑成本和规模。发酵、纯化、复性等工艺研究一般来说中试研究可分为三个阶段：发酵、粗纯（破菌、复性）、纯化，最后得到中试中间产品——原液。一、发酵工艺研究及相关的检测要求在生产工艺研究及确定过程中，需要对工艺研究方法和结果进行详细的记录，其内容包括发酵培养基配方是如何确定的，依据是什么，发酵条件参数（PH值、温度、补料、溶氧、搅拌速度等指标）是如何确定的，诱导表达条件的选择等。这些研究结果都应进行总结，并保留原始记录备查。PICHIA酵母表达系统温度：最适生长温度28—30℃，温度太低会导致生长缓慢而温度太高，影响Pichia酵母的生长与表达，其表达受抑制更为明显。甲醇含量：甲醇含量的控制是Pichia酵母发酵的关键。甲作为Pichia酵母诱导后生长的唯一碳源，也是启动外源基因表达的诱导物。文献报道其表达适合甲醇浓度0.5%--1.5%。PH:Pichia酵母可以在PH3—8范围内生存。菌种培养密度：菌种培养密度应控制在OD6002—6，按1：:1比例接种。过高或过低会影响工程菌的适宜生长及表达。溶氧：Pichia酵母的快速生长需要足够的溶氧，未诱导表达之前应将溶氧控制在30%--40%之间，加入甲醇诱导表达后溶氧应控制在20%--30%之间。工程菌诱导：氮源的利用（外源蛋白大量合成，需要提供充足的氮源，一方面补充氮源，一方面氨水可中和Pichia酵母生长过程中产生的酸性物质，进而调节PH，同时补充一定量的酪蛋白水解物有助于外源蛋白质的高效稳定表达。粗纯（细菌或细胞破碎、复性）工艺研究及相关检测要求细胞破碎常用方法1、物理法（1）机械磨碎法：将细胞置于高速组织匀浆器中进行研磨（2）加压破碎法：将细胞在55MPa的高压下，急速喷射撞击挤压，循环3-4次，该法操作方便，成本较低（3）超声波破碎法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂(4)反复冻融法：将细胞在低温下冰冻，室温溶解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。2、化学处理法(1)自溶法：细胞膜结构在一定条件下，由于细胞自体的各种水解酶如蛋白酶、酯酶等的酶解作用而发生溶解（2）溶菌酶处理：它具有专一破坏细菌胞壁的功能，适合于多种微生物（3）表面活性剂处理法：常用SDS等阴离子表面活性剂（4）脂溶性溶剂处理法：用丙酮、氯仿、甲苯等溶解细胞的脂蛋白（5）用低渗溶液，如氨水、稀盐及含有少量有机溶剂的水溶液等处理，使细胞膜胀破。大肠杆菌表达产物如果是包涵体，需要经过复性工艺研究。复性工艺主要有两种：稀释复性和超滤复性，另外还有近年来出现的采用分子伴侣帮助复性，这些复性工艺帮助蛋白质分子恢复到天然有活性的构象，在建立活性测定方法的基础上对整个复性过程进行检测，以找到最佳的活性点，这些参数包括变性试剂的选择（常用6mol/L盐酸胍和8mol/L尿素）、复性速率的控制复兴后的所有工艺步骤都要首先考虑活性回收率以及活性稳定性，绝对避免蛋白失活。所以所有操作均应有效的控制温度、PH值、缓冲系统（离子强度）、蛋白浓度等参数，同样复兴研究要保存原始记录备查。对复性过程中的各个采样点进行活性测定，做出生物学活性和变性剂浓度变化图，以确定最佳的活性点。复性回收率包括蛋白回收率和活性回收率，作为一个成熟的复性工艺，应确定复试回收率的范围。纯化工艺研究及相关检测要求工艺研究内容根据分离原理不同，纯化工艺方法常见有5种（1）分子排阻层析：根据分子大小进行分离。SEC能分离的分子量范围在1万—200万，平均粒度3—13U，缺点是分辨率低，尤其是分子量相近的分子之间。（2）离子交换层析：根据蛋白质分子表面所带电荷不同进行分离（3)反相层析：根据蛋白质分子的疏水性进行分离，反相层析是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种分离模式。（4）疏水作用层析：与反相层析原理相同，区别在于疏水层析的填料其表面疏水性没有反相层析强，所用填料多为有机聚合物和大孔硅胶键合相，流动相一般为PH6—8的盐溶液。高盐浓度时，蛋白质与固定相缔合，低盐浓度时疏水作用减弱，蛋白质逐步被洗脱下来，与反相层析相比，蛋白质回收率高，变性可能性小。（5）亲和层析：根据生物大分子与特异性亲和力分子相互作用不同进行分离。硫氧还蛋白表达系统可使用镍离子亲和柱。2、检测内容纯化工艺的每一步完成后均应测定收获物纯度，计算提纯倍数、收获率等，要对每一步的纯化效率、活性回收率和蛋白回收率进行检测，只有当这两种回收率呈正相关时，纯化过程才是有效和可行的。工艺验证内容：分离度、目的蛋白回收率、活性回收率、每一步纯度变化情况等，也需要包括色谱柱使用的寿命、保存条件等。纯化方法的设计应考虑到尽量去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖以及纯化过程带入的其他有害物质。纯化过程中尽量避免加入有害物质，若必须加入，应设法除去，并在最终产品中检测残留量，应远远低于有害剂量，还要考虑到多次使用的蓄积作用。如用柱层析技术应提供所用填料的质量认证证明（如ISO90011证书等），并证实从柱上不会掉下有害物质。上样前应清洗除去热原质等。若用亲和层析技术，如单克隆抗体，应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白。如在反相纯化步骤中用到乙腈或甲醇等有机溶剂，用proteinA亲和层析纯化抗体，有机溶剂和proteinA等这些对人体有害的物质应加以去除和控制。工艺流程中一般情况下是先复性（CHO表达系统和酵母表达系统产物一般不需要复性），后纯化，也可以先纯化后复性，或在纯化过程中复性。制剂工艺研究及其质控要求和稳定性研究1、制剂工艺研究及质控要求：经过复性、纯化后的样品留一部分立即分装（约0.5ml/支）冻存（最好—70℃）作为原液。原液留样量应足够6倍的检定量。除了保证自检用样品盒国家检定机构复核检定用样品，还必须保留足够2次全检量样品，用于原液稳定性研究和保证可以对成品质量问题的追溯。原液一般是指最后一步纯化收集液，在配制成成品前的稀释或浓缩样品应作为原液半成品是指分装成成品前的溶液，其中已加入了赋形剂，组分与成品一样。成品的制备要求：1、分装环境要求：人员、环境按GMP要求净化，分装必须在百级条件下完成，不同品种、不同批号不得同时分装2、半成品配制后必须混匀，必须在规定的时间内分装完成，不得反复冻融。3、分装机或分装移液器必须做分装精度试验，分装精度一般要求1%以内4、冻干：研究目的蛋白的共熔点，确定冻干曲线5、标签的设计、批号的编制应严格按照《中国生物制品规程》现行版要求进行。6、制剂处方一般要求药用试剂，其质量标准应符合《中国药典》和《中国生物制品规程》的有关要求，特殊处方试剂需要提供处方的理由和相关的安全性资料。2、稳定性研究中试研究样品的产量至少应保证I期和II期临床用药量以及至少5倍的检定用药量，还必须留样进行稳定性研究。稳定性评价可能需要采用复杂的办法，生物学活性测定是其中关键项目之一，如果制剂的纯度和组分适当，也可以用适当的理化、生化、免疫化学方法分析被测定物的含量和降解物的含量。对制剂稳定性研究需考虑的几方面1、在确定了所有生产工艺后，要连续生产至少三批制品并经过全面检测以检验生产工艺的稳定性和产品质量的稳定性。2、检测指标应包括生物学活性、纯度、理化特性（如分子量、电荷、疏水性、蛋白质脱氨基、氧化、硫酰化等）、无菌试验、外观、赋形剂可能出现的降解情况以及容器对产品的有害的影响等。单一的稳定性参数往往不能全面反映生物技术产品的稳定性特征，生物学活性测定方法的变异也会对稳定性分析的准确性产生影响。3、应进行真实时间和真实温度的稳定性研究（与实际储藏温度和条件相同），加速条件和强力破坏研究也必须进行。4、对样品储藏条件的要求因素有：温度、湿度（密闭容器可以忽略）、光（不同制品区别对待）、容器/瓶盖、冻干品重建溶液的保存条件等。5、检测频率：生物技术产品有效期一般为几天到几年，除非有特别规定，一般检测的时间是半年到5年。批准上市后还要继续进行稳定性研究，不过检测时间间隔可以延长。层析关于装柱和使用，有哪些需要注意的1、装柱前要仔细看填料的使用说明书，每种填料都有自己的特性，以及特殊的装柱方法，针对不同的空柱，也要注意方法可能不同；2、填料要加水搅拌成均匀悬液，悬液浓度依填料而不同，一般70－85%，迅速倒入空柱内，或吸或压，流速和具体步骤看说明书。3、这一点非常重要：装柱包括以后使用中绝对不允许柱内进入气泡（bubblefree），柱头事先也要排除气泡。4、选择合适的泵，首先是流速满足要求，脉冲尽量小。首选柱塞泵。5、所有柱子尽量做到填料均匀，尤其是用于凝胶层析的柱子。装柱完成后，可用柱效测定的方法检查装填效果。一个装填合格的柱子的理论塔板高度应是填料平均粒径的2－4倍，在此范围内越小越好。6、准备上柱的液体应进行过滤，至少是0.45micrometre。7、至于测序，大概不到1mg应该足够了。8、关于纯化，首先要考虑的是你的目标：纯度、数量、速度、收率等等，再根据样品的具体情况，尤其是目标蛋白的性质，确定纯化策略。通常三步曲：capture、purification、polishing。第一步先从大量或复杂样品中将目标蛋白“抓出”，与主要杂质分离；再用高选择性的层析去除绝大部分杂质；最后精细纯化，提供纯度至设定目标。到实际工作中，不要死靠三步，也许一步也许四步或更多，具体情况具体分析。所谓“三步”只是一种思路而已。C20-MTS中试纯化主要仪器和试剂低温高速离心机、匀浆机、超声波破碎仪、摇床、超净工作台，AKTAprimer，泵？超滤仪器、sephadexTMG-25fine，柱子规格1.6×20cm和2.6×40cm，填料NI-NTA(25ml)脱氧胆酸钠，DTT，GSSG,L-精氨酸，尿素，trisbaseIPTG1、种子准备：100ul菌液5ml试管（含A+、K+)摇床过夜培养含100mlLB培养基的烧瓶含250mlLB的摇瓶过夜15L发酵罐+800ml30%葡萄糖。2、中试发酵：OD600为7.56时加入IPTG(终浓度1mM)诱导表达，加碱液迅速调PH至7.0.发酵完成后连续离心收集菌体。3、包涵体破碎洗涤溶解：3.1100g菌体加1LPBS(0.1M）溶解，超声破碎4S,间隔4s，99*3次。3.2破碎菌液8500rpm,15min,10℃离心。3.3用含2M尿素的PBS洗涤离心沉淀，再8500rpm,15min,10℃离心。3.4沉淀用含0.4%脱氧胆酸钠的PBS洗涤，再8500rpm,15min,10℃离心收集沉淀3.5沉淀用PBS清洗2~3次，8500rpm,15min,10℃离心收集沉淀。3.6将沉淀溶于1Llysisbuffer，加终浓度1mMDTT4℃搅拌过夜。8500rpm,15min,10℃离心收集上清4、NI—NTA亲和层析4.1约20ml体积的NI-NTA填料装柱，纯水洗2~