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临床免疫与检验概论1、免疫——是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能。免疫应答是机体免疫系统接收抗原刺激发生一系列反应，并以排出或分解抗原为目的的反应过程2、免疫应答包括三个过程——识别阶段、活化阶段、效应阶段。3、脾——是含血管的最大外周淋巴器官4、粘膜伴随的淋巴组织——在呼吸道、肠道及泌尿生殖道的粘膜上皮细胞下，均聚集着无包膜的淋巴组织，如扁桃体、小肠的派氏集合淋巴结、阑尾5、免疫细胞——参与免疫应答有关的细胞统称为免疫细胞。1、淋巴细胞2、单核-吞噬细胞3、参与免疫应答的细胞。包括中性粒、嗜酸性粒、肥大细胞等。6、外周血中的T淋巴细胞约占淋巴细胞的70-75%7、CD3分子转导T细胞活化的第一信号。8、簇分化抗原CD-——T细胞亚群在不同发育阶段存在不同的分化抗原，这是区分T淋巴细胞的重要标志9、NK细胞——自然杀伤细胞。来源于骨髓干细胞，发育成熟依赖于骨髓和胸腺微环境，NK细胞无需抗原刺激可以非特异性直接杀伤肿瘤和病毒感染的靶细胞，在机体免疫监视和早期抗感染免疫过程中起重要作用。活化NK细胞可分泌IFNγ和TNFα等细胞因子。10、免疫辅助细胞——免疫应答的过程中，淋巴细胞，尤其是T淋巴细胞的活化需要非淋巴细胞的参与，辅助淋巴细胞活化的细胞称为辅佐细胞。主要包括单核—吞噬细胞系统和树突状细胞两类。11.吞噬细胞的共同特征是表达MHCII类分子具有吞噬作用。12.免疫球蛋白——B细胞经抗原刺激后增殖分化为浆细胞产生的一类执行体液免疫功能的一组球蛋白。分为分泌型(sIg)和膜型（mIg）。分泌型存在于体液中，膜型作为抗原受体表达于B细胞表面。13.免疫球蛋白化学结构——由2条相同的重链H和2条相同的轻链L以及几对二硫键构成的四肽结构，构成一个Ig基本单位,称为单体。14.Ig的分类——Ig重链恒定区，按照重链抗原性将Ig分为五类，IgG、IgA、IgM、IgD、IgE.IgG4个亚类，IgM和IgA2个亚类15、IgG——是血清中含量最高的Ig，是再次免疫应答的主要抗体，也是唯一通过胎盘的抗体。超敏反应II抗体也是IgG，免疫学检测中的第二抗体也是IgG。16.IgA——分为血清型和分泌型。大部分血清型IgA为单体。分泌型IgA（sIgA）为二聚体，性能稳定，主要存在于胃肠道、支气管、初乳，局部浓度高，参与粘膜局部免疫的主要抗体。17、IgM——五聚体。Ig中分子量最大的。个体发育合成最早的抗体，也是抗原刺激后体液免疫出现最早的抗体。感染过程中IgM升高，说明近期感染，新生儿血清IgM升高提示宫内感染18、IgE——单体结构，在血清Ig中水平最低，为亲细胞抗体，介导I型超敏反应。寄生虫早期感染升高。19、IgD——B细胞膜上的IgD是B细胞分化成熟的标志。20、补体——存在人和脊椎动物血清及组织液中一组具有酶样活性的球蛋白。补体的激活途径分3种，经典途径、替代（旁路）途径、MBL途径1）经典途径——结合抗原后的IgG或IgM为主要激活剂，补体C1—C9共11种成分全部参与激活途径。除抗原抗体复合物，还有许多薪资可以激活，如非特异性凝集的Ig、细菌脂多糖、双链DNA2)旁路途径——病原微生物等细胞壁成分提供接触面直接激活补体C3，然后完成C5—C9的过程。主要激活物是细胞壁的成分3）MBL——急性炎症期产生的甘露糖凝集素MBL与病原体结合启动。21、补体的大多数组分是糖蛋白，多属于β球蛋白，正常血清中含量最高的补体是C3、C4。加热56℃30分钟可以使血清中绝大部分补体组分丧失活性，称为灭火或灭能。22、细胞因子——是由免疫细胞分泌的一类具有生物活性的多肽或小分子蛋白质的总称。活性常表现为多效性、重叠性、拮抗效应和协同效应。分为六大类，白细胞介素、干扰素、生长因子、趋化因子家族、肿瘤坏死因子、集落刺激因子。23、粘附分子——CAM是介导细胞间或细胞与细胞外基质间相互和粘附作用的小分子多肽和糖蛋白的总称。以受体配体的结合形式发挥作用。抗原抗体反应1、抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）和抗体超变区分子间的结构互补性和亲和性。2、免疫技术的亲和层析利用抗原抗体结合的可逆性3、抗体过量，称为前带。抗原过量称为后带。4、颗粒性抗原出现凝集反应，可溶性抗原出现沉淀反应，单价抗原与相应抗体结合不出现沉淀反应。5.用0.85%的Nacl或各种缓冲液作为抗原抗体的稀释液。抗原抗体反应一般在PH6—9之间进行。温度一般在15—40℃适宜。常用温度为37℃，温度如高于56℃，抗体抗原解离6、木瓜酶可将IgG裂解为2个Fab片段和1个Fc片段。胃蛋白酶可将IgG裂解成F(ab’)2片段及数个小片段。胰蛋白酶可将IgG切成不规则的肽链。7、蛋白含量的鉴定——常用的是紫外光吸收法，测定280nm和260nm8、半抗原——某些物质在独立存在时只具有抗原性而无免疫原性，半抗原和蛋白质载体或高分子聚合物结合后才有免疫原性9、载体蛋白类常用牛血白蛋白，多肽聚合物常用多聚赖氨酸免疫佐剂10、最常用于免疫动物的佐剂是弗氏佐剂，分为弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂（加卡介苗），佐剂和抗原的比例是1:111、抗血清分为R型和H型。R型抗血清是用家兔为代表的小型动物免疫产生的抗体，特点是亲和力较强，抗原抗体反应后不易发生解离，适于诊断试剂；H型抗血清是用马等大型动物免疫产生的抗体，特点是亲和性较弱，抗原抗体反应后易解离，用于免疫治疗。12、IgE对绵羊、胰岛素对家兔、多种酶对山羊，免疫后均不产生抗体。蛋白质抗原常用的是山羊和家兔。13、免疫途径——皮内或皮下免疫时一般采用多点注射，初次免疫一般选择皮内接种，加强免疫和颗粒性抗原一般选用静脉注射，宝贵抗原选择淋巴结注射。14、免疫间隔时间是影响抗体产生的重要因素。第1次与第2次免疫间隔时间以10—20天为好，第3次及以后的间隔一般为7—10天15、动物采血法——最常用为颈动脉采血，其次心脏采血和静脉采血。抗血清的鉴定和保存1、抗体特异性鉴定——常用双向免疫扩散法。1）若粗抗原和纯抗原之间皆出现一条沉淀线，且两者互相融合，证明该动物已产生单价特异性抗体。2）若纯化抗原出现一条，而粗抗原出现多条线，且一条沉淀线与纯抗原沉淀线相连，也是成功的免疫，取血后将杂抗体吸收除去，可以成为单价特异性抗体3）若不出现沉淀线。则免疫失败2、抗体效价的测定——颗粒抗原采用凝集试验；可溶性抗原采用双向免疫扩散试验、ELISA。测定抗体效价有两种稀释:1）经过系列稀释的血清与同一浓度的抗原反应2）同时稀释抗血清和抗原，分别与不同浓度的抗血清进行双向免疫扩散试验（棋盘滴定）3、抗血清的保存1)2—8℃，用于短期保存2）冷冻保存—常用的抗体保存方法，—80℃～—20℃，一般可以保存5年，小包装避免反复冻融3）真空干燥保存——保存5—10年单克隆抗体与基因工程抗体的制备1、单克隆抗体——B细胞克隆产生针对单一表位、结构相同、功能均一的抗体2、杂交瘤及时——利用聚乙二醇PEG为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，最终获得既能产生所单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。具体包括两种亲本细胞的选择与制备、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选和克隆化※PEG可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构的重排，3、单个细胞培养又称为克隆化。杂交瘤细胞目前均采用液氮保存细胞4.从培养液或腹腔积液获取的单克隆抗体，不需要纯化即可用于日常诊断或定性研究如果用于免疫标记测定，如放射性核素、生物素、酶等。必须进一步纯化和分离。4、单克隆抗体的特性——高度特异性、高度的均一和可重复性、弱凝集反应和不呈现沉淀反应、对环境敏感性凝集反应1、凝集试验——是定性和半定量的检测。2、直接凝集反应——参与凝集反应的抗原称为凝集原。1）玻片凝集试验——用于抗原的定性分析——细菌菌种和分型，ABO血型测定2）试管凝集试验——肥达试验、外斐试验、交叉配血。3、胶乳凝集试验——间接凝集试验，所用载体是聚苯乙烯胶乳。4、抗球蛋白试验——Coombs试验是检测红细胞不完全抗原的一种很有效的方法。直抗用于检测红细胞上的不完全抗体，间抗用于检测游离血清中的抗体。沉淀反应1、沉淀反应——可溶性抗原与相应抗体在特定条件下发生特异性结合出现的沉淀现象。抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质2、抗原过量，出现钩状效应。当反应中抗体过量时，IC的形成随着抗原递增而增加，抗原抗体最适比达到高峰，这就是经典的海德堡曲线理论3、免疫比浊法的原理——反应体系中保持抗体适当过量。4、单项扩散试验——琼脂内混入抗体，待测抗原重局部向琼脂内自由扩散，形成沉淀环。1）Mancini曲线——大分子抗原和长时间（48h）扩散的结果，c/d2=k2)Fahey曲线——适用于小分子抗原、较短时间（12h）扩散的结果。Logc/d=k双环显现——出现两种抗原性相同成分5、双向扩散试验——抗血清抗体效价滴定的常规方法。1)沉淀线如果靠近抗原孔，抗体过量；沉淀线靠近抗体孔，抗原过量；不出现沉淀线，无对应的抗体或抗原或抗原过量。2）沉淀线弯向分子量大的一方。3）沉淀线互相吻合相连，两个抗原相同；沉淀线相切，抗原部分相同；沉淀线交叉，抗原完全不同6、免疫电泳技术——电泳分析和沉淀反应结合产物。1）对流电泳——将双向免疫扩散与电泳结合的定向加速的免疫扩散技术。IgG3和IgG4与一般蛋白质无异，泳向正极。而IgG1和IgG2带电荷少，受电渗的作用力大于电泳，被水分子挟裹向负极。2）火箭免疫电泳——加速的单向扩散3）免疫电泳——区带电泳和免疫双向扩散结合。MM患者血清在免疫电泳后，可观察到M蛋白沉淀弧4）免疫固定电泳——电泳加沉淀反应，用于各种蛋白质的鉴定。对M蛋白的鉴定和分型，尿液本-周蛋白的k、γ分型；脑脊液中寡克隆蛋白的检测及分型5）交叉免疫电泳——区带电泳和火箭免疫电泳结合，对多种抗原定量。放射免疫分析1、放射免疫技术——基于竞争性结合反应原理的放射免疫分析RIA和后来的非竞争性结合的免疫放射分析IRMA。放射性核素常用I125，特别适合激素、多肽、等含量微小物质的超微量分析。1)放射免疫分析RIA——放射性核素标记的抗原和反应体系中为标记抗原竞争结合特异性抗体检测待测样品中的抗原量2)免疫放射分析IRMA——放射性核素标记过量抗体与待测抗原直接结合，采用固相免疫吸附载体分离结合与游离标记抗体的非竞争放射免疫分析。※RIA可以测定大分子和小分子抗原，IRMA只能测定至少有两个抗原决定簇的抗原。2、I125制备标记物的基本原理——放射性碘原子通过取代反应置换被标记分子中酪氨酸和酪氨残基及组氨残基上的氢原子3、放射标记物的鉴定——1、放射化学纯度（一般要求大于95%）2、免疫活性3、比放射性（单位化学量标记物中所含的放射性强度）荧光免疫技术1、时间分辨率荧光免疫测定——利用延时测定的方法消除某些短命荧光的干扰2、异硫氰酸荧光素FITC呈现黄绿色荧光。四乙基罗丹明RB200——橘红色荧光四甲基异硫氰酸罗丹明TRITC——橙红色藻红蛋白R-RE——橙色3.镧系鳌合物——铀EU3+应用呢最广，适合时间分辨荧光免疫测定4.荧光素和蛋白质的结合比率F/P——一般用于组织切片的荧光抗体其F/P=1.5为宜，用于活细胞染色以F/P=2.4为宜。抗体效价＞1：16较为理想。5时间分辨率荧光免疫——非放射性核素免疫，利用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素鳌合物的发光特点，同时检测时间和波长两个参数进行信号分辨，可有效的排出非特异性的荧光干扰。※Stokes移位——激发光谱和发射光谱的波长差6.荧光偏振免疫测定——抗原抗体竞争反应原理，根据荧光素标记抗原与其抗原抗体复合物的荧光偏振程度的差异，测定体液中小分子物质的含量。不适宜大分子物质检测※荧光偏振免疫测定常用的FITC标记小分子抗原7、荧光酶免疫测定——以ALP标记抗体或抗原，以固相载体包被抗原或抗体，以4-甲基伞酮磷酸盐4-MUP位ALP反应的荧光底物，AIP分解4-MUP,脱磷酸根基团后形成4-MU，经过360nm激发光照射，发出450nm的荧