免疫分析方法

免疫分析方法免疫学方法在食品分析中正得到越来越广泛的运用，其中酶联免疫吸附法（ELISA）已经在食品工业中广泛应用，它能够用于测定人们希望含有的物质，以及不希望含有的物质。例如现在人们所关注的食品安全性问题中一些物质的检测：杀虫剂、药物残留物、激素、生长素、微生物毒素、真菌毒素或肠毒素、天然毒素，以及一些添加剂。免疫分析法具备有效的灵敏度、特异性、快速和低成本的优点；可对大量的样品进行常规分析；能够用于样品的定性筛选，也能够对样品进行定量测定以确定样品中待测组分的含量。免疫分析技术免疫分析技术的分类标记免疫分析技术非标记的免疫分析技术免疫扩散免疫电泳酶联免疫分析放射免疫分析荧光免疫技术化学发光免疫技术胶体金免疫技术抗原及相应的抗体分子在凝胶中扩散相遇，达到合适浓度比例时形成抗原抗体复合体沉淀的技术。可以检测特定的抗原或抗体。抗原与抗体成分的一种定性与半定量分析方法，通常采用半固态透明琼脂凝胶作为支持介质。置于孔中的抗原和抗体相向扩散，在两者浓度比例适当处相遇后如能结合形成复合物则形成沉淀线。分为单向扩散（singleimmunodiffusion）、放射状扩散（radialimmunodiffusion）和双向扩散（doubleimmunodiffusion）等。1.1免疫扩散1、非标记免疫分析技术实验原理可溶性抗原和相应抗体在含有电解质的琼脂凝胶中扩散相遇，特异性地结合，在比例合适处，形成肉眼可见的沉淀物的一种免疫血清学技术。（一）单向扩散实验一种定量实验，将一定量的抗体混合于琼脂内，倾注于玻片上，凝固后，在琼脂层上打孔，再将抗原加入孔中，使其向四周扩散。抗原抗体复合物形成的沉淀环直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线，则未知标本中的抗原含量即可从标准曲线中求出。本实验主要用于检查标本中各种免疫球蛋白和血清IgG含量。（二）双向扩散实验抗原抗体在一定pH和离子存在的琼脂糖凝胶中相向扩散，一定时间后，两者相遇而形成不明显的抗原抗体聚合物并继续扩散，当扩散至两者的适当比例时便形成大的抗原抗体复合物而出现明显沉淀，形成垂直于扩散方向的免疫沉淀线即等价线。1.2免疫电泳免疫电泳是一种将区带电泳和双向免疫扩散相结合的免疫化学分析技术。实验原理先将抗原样品在琼脂平板上进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而被分离成肉眼不可见的区带。停止电泳后，在与电泳方向平行的槽内加入相应抗血清，使抗原和抗体呈双向扩散，已分离的各抗原与相应抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例合适处形成肉眼可见的沉淀弧。根据沉淀弧的数量、位置和形状与已知标准抗原进行比较，可分析、鉴定样品中所含的抗原成分及其性质。采用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。2、免疫标记技术2.1酶联免疫法•免疫酶技术：把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理有机地结合起来。它具有免疫荧光试验和放射免疫试验的优点，并克服上述两种方法的缺点。•酶标记试剂制备容易、稳定、有效期长，免疫酶技术的敏感性接近放射免疫试验，可直接肉眼观察也可借助简单的仪器作定量测定，所得结果比较客观。ELISA的基本原理和方法ELISA的种类和变化ELISA的特点ELISA的应用实例酶联免疫吸附法ELISA基本原理ELISA是一种免疫测定（immunoassay，IA）基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体（免疫吸附剂）②酶标记的抗原或抗体（标记物）③酶作用的底物（显色剂）酶及其底物酶结合物是酶与抗体或抗原,半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物，将得到不同的颜色反应。酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420β-Ｄ-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,450420ELISA的种类和变化（一）双抗体夹心法（二）间接法（三）竞争法（四）双位点一步法（五）捕获法测IgM抗体（六）应用亲和素和生物素的ELISA（一）双抗体夹心法此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原步骤：A将已知抗体吸附于载体上，温育后清洗；B加入待检标本溶液，使溶液中的抗原与吸附的抗体结合，温育后清洗；C加入酶标记特异性抗体，温育后清洗；D加入酶作用底物，产生显色反应，颜色的改变与所加的待检标本溶液中的抗原量成正比。间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。（二）间接法步骤：A将已知可溶性抗原吸附于载体（聚苯乙烯板或聚乙苯乙烯小珠），经温育后清洗；B加入待检稀释血清，若血清中有相应特异性抗体存在则与吸附的抗原结合，温育后清洗；C加入酶标记的抗球蛋白抗体，此时酶标记抗抗体与吸附的抗原抗体复合物结合，温育后清洗；D加入酶作用底物（或称基质），酶分解底物并显色，用光电比色计测定底物显色深浅，即可推知抗体量。（三）竞争法此法可用于检测小分子抗原。步骤：A将已知抗体吸附于固相载体表面，温育后清洗；B将可能含抗原的待检溶液和酶标记的已知抗原溶液以适当比例混合，加入已包被的载体孔中，温育后清洗；C加入酶作用的底物，产生显色反应。色深表示结合的酶标记抗原多，而待检溶液中未标记的抗原量少；反之，色浅表示结合的酶标记抗原少，而待检溶液中抗原量多。ELISA特点特点一：灵敏性该测定法的灵敏度来自酶。众所周知,酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。ELISA实现了在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。特点二：特异性其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。饲料安全检测农药的检测疾病诊断ELISA应用实例饲料中盐酸克伦特罗的测定饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素，简曲霉毒素）饲料中有害微生物的快速筛检（如沙门氏菌）甲胺磷残留分析甲基对硫磷残留分析呋喃丹残留分析ELISA在饲料安全检测中的应用ELISA用于农药残留的检测河豚毒素植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素苯并芘主要有除草剂与杀虫剂两大类例如杀暝松（FN）、甲氟磷酸异已酶（SOMAN）、草不绿（Alachor）、西维因（Carbaryl）、多菌灵及克菌丹（Captan）等。农药的检测：ELISA检测“非典型肺炎”冠状病毒ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体ELISA在疾病诊断中的作用ELISA法检测幽门螺杆菌抗体ELISA法测定SARS抗体效价SARS抗体效价的测定．目前国内外报道的定性检测方法主要有：间接免疫荧光法(IFA)、病毒中和蚀斑法和ELISA方法。由于ELISA方法具有灵敏度高，操作简便，样本处理量大，可定量测定等优点。我们选择了ELISA法进行改进．建立了SARSIgG抗体效价定量测定的方法。经初步验证，该方法的稳定性、准确度、重复性、精密度、特异性、线性和范围等均能达到免疫学定量测定方法的要求．适用于血浆及静脉注射用人SARS免疫球蛋白制品的SARSIgG抗体效价检测和质量控制。ELISA试剂盒商业资讯ELISA试剂盒DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪DNM-9602A酶标分析仪几种酶标分析仪2.2放射免疫标记技术放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）是1959年由Berson和Yalow首先用于糖尿病患者胰岛素含量的测定，是一种将同位素分析的灵敏性和抗原抗体反应的特异性这两大特点结合起来的免疫标记测定技术。女科学家R.Yalow（美,1921~）1950’末发明（胰岛素），1977年获诺贝尔医学奖放射免疫优缺点其优点是灵敏度高、特异性强、精确性好、样品用量少，而且不需要复杂的提纯步骤。缺点是需要特殊的仪器设备和一定的防护条件，而且有些同位素标记物的半衰期较短以及试验废物难以处理，对环境造成放射性污染。基本原理放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物＆寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药物等），而标记抗原使将已知的上述物质标记上放射性同位素，具有示踪作用。（1）竞争结合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：常用标记核素：（1）125I：γ射线，半衰期60天（2）3H：β射线，半衰期12.3年测量仪器（1）γ计数仪（2）β液闪仪放射免疫分析的临床应用•临床常用近200种•（1）肿瘤相关抗原的测定：AFP、CEA、CA199、CA-125、CA153、CA724、CYFRA211、PSA等•（2）激素的测定：下丘脑-垂体-甲状腺轴激素，下丘脑-垂体-性腺轴激素，下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴激素，胃肠道激素，心血管激素，甲状旁腺素与降钙素，生长激素等•（3）非激素蛋白质的测定：铁蛋白、各种尿微量蛋白、铜蓝蛋白、肌红蛋白、血栓素、III型前胶原肽、层黏蛋白等•（4）酶的测定：前列腺酸性磷酸酶、SOD、NSE等•（5）药物及维生素的测定：地高辛、叶酸、VitB12等•（6）免疫分子的测定：各种Ig、抗DNA、IL、CD、CIC•（7）病原学研究：现已基本淘汰，但细菌代谢产物的测定仍有一定的价值•（8）其它：甘胆酸、透明质酸等基本原理放射免疫测定是建立在待测抗原和标记抗原对有限量抗体进行竞争性结合的基础上。待测抗原是指人体内某种微量活性物质（如微生物＆寄生虫抗原、激素、维生素、酶、药物等），而标记抗原使将已知的上述物质标记上放射性同位素，具有示踪作用。（1）竞争结合分析：Ag+AbAgAb*Ag+Ab*AgAb（2）IRMA（免疫放射分析）：常用标记核素：（1）125I：γ射线，半衰期60天（2）3H：β射线，半衰期12.3年测量仪器（1）γ计数仪（2）β液闪仪应用：放射性免疫检测四环素类药物残留测试原理本方法的基本原理是微生物细胞表面存在着能与各种四环素类药物共有功能基团相结合的特异性位点，能与各种四环素类药物发生相应的微生物受体反应。检测四环素类药物残留时，同时加入微生物受体结合物和『3HI标记过的金霉素。如果样品中残留有四环素类药物，就会同[3H1标记过的金霉素竞争结合微生物受体结合物的相关位点。用液体闪烁计数仪测定样品反应后的【3HJ含量的cpm值(countperminute，即每分钟脉冲数)，cpm值与样品中的四环素类药物残留量成反比。免疫荧光技术免疫荧光分析(Immunofluorescenceassay，IFA)始创于40年代初，1942年Coons等多次报道用异氰酸荧光素标记抗体．检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原，当时由于此种荧光素标记物的性能较差，未能推广使用。直至50年代末期，Riggs等(1958)合成性能较为优良的异硫氰酸荧光黄。Mashall等(1958)对荧光抗体的标记方法又进行改进，从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。2.3荧光免疫分析（IFA）常用荧光免疫的类型•（1）荧光免疫染色：主要用于抗原抗体的定位，用荧光显微镜观察•（2）荧光免疫测定a.荧光偏振免疫测定（