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第四章药物定量分析与分析方法的验证第四章第四章药物定药物定量分析与分析方法分析与分析方法的验证的验证³样品的前处理方法³生物样品分析方法及基本要求第一节样品的前处理方法¾一、概述z含金属药物：富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠、枸橼酸铋钾、葡萄糖酸锌、酒石酸锑钾等。z含卤素药物：泛影酸、三氯叔丁醇、碘番酸、磺溴酞钠等。第一节样品的前处理方法¾一、概述z含金属药物：富马酸亚铁、葡萄糖酸锑钠、枸橼酸铋钾、葡萄糖酸锌、酒石酸锑钾等。z含卤素药物：泛影酸、三氯叔丁醇、碘番酸、磺溴酞钠等。处理方法分两大类：不经有机破坏处理经有机破坏处理¾二、不经有机破坏处理的分析方法z直接测定法适用于金属原子不直接与碳原子相连的含金属有机药物或某些C—M键结合不牢固的有机金属药物富马酸亚铁的含量测定ChP(2000)取本品约0.3g，精密称定，加稀硫酸15ml，加热溶解后，放冷，加新沸过的冷水50ml与邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液(0.1mol/L)滴定，并将滴定的结果用空白试验校正。每1ml硫酸铈滴定液(0.1mol/L)相当于16.99mgC4H2FeO4CHCOOCHCOOFeHClFe2+z经水解后测定法适合于卤素与脂肪碳链相连的药物，经加热回流使其水解，有机结合的卤素转变成无机的卤素离子例1三氯叔丁醇的含量测定（直接回流）CCl3-C(CH3)2-OH+4NaOH3NaCl银量法测定氯化钠含量。回流z经氧化还原后测定法碱性还原后测定——当卤素结合于芳环上时，因结合较牢固，需在碱性条件下加还原剂回流，使X-C键断裂，形成无机卤化物后测定。COONaIIINHCOCH3CH3COHN+3Zn+11NaOHCOONaNH2NH2+3NaI回流NaI＋AgNO3→AgI↓曙红钠指示剂例：泛影酸的含量测定酸性还原后测定本法是将含卤素有机药物在酸性下，加还原剂（如锌粉）加热回流，药物产生还原裂解反应，使有机结合的卤素转变为无机的卤素离子，然后采用银量法（Fajans法）测定。本法适用于测定结构中碘与苯环直接相连，且一个苯环上含多个碘原子的含卤素有机药物。JP采用冰醋酸酸性条件下用锌粉还原，硝酸银滴定液滴定，以四溴酚酞乙酯为指示剂，终点时沉淀由黄色变为绿色。USP，BP，ChP均采用氢氧化钠碱性条件下用锌粉还原，然后用硝酸银滴定液滴定，但指示终点方法不同，ChP采用吸附指示剂曙红钠，USP采用吸附指示剂四溴酚酞乙酯，BP采用电位法指示终点。例碘番酸的测定利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量（直接测定法）（1）含锑药物：利用五价锑有机药物中可游离的Sb5+的氧化性，在酸性液中氧化碘化钾，并定量析出碘，可用硫代硫酸钠液滴定。例如葡萄糖酸锑钠（2）含铁药物：将含铁药物加酸溶解后，便游离出Fe3+，利用Fe3+在酸性溶液中氧化碘化钾，析出的碘可用硫代硫酸钠液滴定以测定含量。三、经有机破坏的分析方法适用于金属原子与碳原子结合牢固的有机金属药物。1.湿法破坏（1）硝酸-高氯酸法本法适用于血、尿、组织等生物样品的破坏，有机金属药物经破坏后，得到的无机金属离子一般呈高价态。本法不能用于含氮杂环药物的破坏（可改用干法破坏）（2）硝酸-硫酸法本法适用于大多数有机物质的破坏，破坏得到的无机金属离子均为高价态。本法不能用于含碱土金属有机药物的破坏（改用HNO3-HClO4法）（3）硫酸-硫酸盐法本法是往样品中加入浓硫酸作氧化剂，加入硫酸盐提高硫酸的沸点，增强硫酸的氧化破坏能力，且防止硫酸的分解损失。本法常用于含砷或锑有机药物的破坏，破坏得到的无机金属离子多为低价态。（4）其它湿法硝酸—硫酸—高氯酸法硫酸—氧化剂法（过氧化氢法、高锰酸钾）破坏后，金属呈高价态注意：9湿法破坏的仪器一般为凯氏烧瓶；9试剂应不含被测离子或干扰测定的成分；9由于矿酸量数倍于样品，须做空白实验校正；9操作须在通风橱内进行。2.干法破坏适用于湿法不易破坏完全的有机物以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物,也可用于某些药物中硒和砷盐的检查。分为：高温炽灼法和氧瓶燃烧法。氧瓶燃烧法（Oxygenflaskcombustionmethod）将有机药物放入充满氧气的密闭燃烧瓶中进行燃烧，并将燃烧所产生的欲测物质吸收于适当的吸收液中，然后根据欲测物质的性质，采用适宜的分析方法进行鉴别、检查或含量测定NaClHClOClClNaOH2⎯⎯⎯→⎯↑⎯⎯→⎯+−溶液点燃适用于含卤素、硫、氮、硒等有机药物的分析仪器装置铂金丝硬质玻璃燃烧瓶样品无灰滤纸透明胶纸燃烧、催化称样燃烧分解操作（通O21-2min，燃烧）吸收液9水-NaOH（含碘、氯药物）例盐酸胺碘酮、碘苯酯、甲状腺粉9水-NaOH-H2O2（含溴、含硫药物）例磺溴酞钠9水（含氟药物）9硝酸溶液（含硒药物）9注意：防爆，燃烧瓶应洗涤干净，不得残留有机溶剂，燃烧瓶应洗涤干净，不得残留有机溶剂，也不能用有机润滑剂涂抹瓶塞；也不能用有机润滑剂涂抹瓶塞；燃烧产生的烟雾完全被吸收，产生的热气往往使产生的热气往往使塞子被顶动，因此点燃后，必须立即用手按紧瓶塞子被顶动，因此点燃后，必须立即用手按紧瓶塞，直到火焰熄灭；塞，直到火焰熄灭；氧气要充足，燃烧应完全；测定含氟药物应用石英燃烧瓶。BrBrBrBrCCHOOHOOSO3NaSO3Na4燃烧分解NaBrBr-+Ag+AgBr剩余的Ag++SCN-AgSCN例1银量法——含氯、溴药物（例磺溴酞钠）燃烧分解后的测定方法9滴定法例2碘量法——含碘药物（例盐酸胺碘酮）OOIH3CNCH3CH3OIHCl燃烧分解I2NaI+NaIOI2+NaOHNaIONaIO3+NaINaI+Br2NaIO3（Br2+HCOOHHBr+CO2）NaIO3+5KI3I2H+I2+Na2S2O3NaI+Na2S4O6第二节生物样品分析方法及基本要求分离、纯化、浓集、化学衍生化¾生物样品进行前处理的目的：①药物进入体内后有ADME过程。在体液、组织和排泄物中除了原型药物，还有药物的代谢物、药物与蛋白质形成的结合物以及药物或其代谢物与内源性物质结合物，需要分离后测定药物及代谢物；②生物样品的介质组成比较复杂，影响含量测定。¾常用样品的种类、采集和贮藏z血样血浆(plasma)(加抗凝剂，离心，取上清液）血清(serum)(采血后0.5-1h，去血饼，离心，取上清液）全血（wholeblood）（加抗凝剂）血样采取后应及时分离，冰冻保存（-20℃）z唾液（saliva）唾液的采集一般在漱口后15min收集，采集后立即测量其除去泡沫部分的体积。放置后分为泡沫部分、透明部分及灰乳白色沉淀部分三层，离心后分取上清液供药物浓度测定。为阻止粘蛋白产生，应在4℃以下冷藏保存注意：唾液中药物浓度较低，需高灵敏度的方法才能检测z尿液（urine）尿液通常收集一定时间内全部尿液，记录其体积，取一部分尿测定药物浓度，然后乘以尿量求得排泄总量。尿药测定主要用于药物剂量回收研究、尿清除率、生物利用度研究、代谢物测定以及预测药物代谢过程。采集后应冷藏或加防腐剂（甲苯、氯仿、浓盐酸等），若长时间保存，应冰冻。注意：尿液中药物浓度改变不能直接反映血药浓度。¾生物样品分析前处理技术z一般考虑生物样品种类9血---除蛋白质；9尿---缀合物水解9唾液---除去粘蛋白药物理化性质9酸碱度，溶解性，挥发性，紫外吸收性质，稳定性等z去除蛋白质目的：9使药物从结合状态下释放出来，9减少提取过程中的乳化9消除干扰，保护色谱柱常用去蛋白方法：9加入与水相混溶的有机溶剂——使蛋白质分子内及分子间的氢键发生变化而使蛋白质凝聚，与蛋白质结合的药物被释放出来（甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、丙醇、四氢呋喃）。一般离心速度在10000r/min（用具塞塑料离心管）。9加入中性盐，如（NH4)2SO4，Na2SO4等，将与蛋白质水合的水置换出来，使蛋白质脱水而沉淀。9加入强酸（10%三氯乙酸、6%高氯酸等）在低于蛋白质等电点pH时，与蛋白质阳离子形成不溶性盐而沉淀。9加入Zn2+、Cu2+在高于蛋白质等电点pH时，与蛋白质阴离子形成不溶性盐而沉淀。9酶解法（蛋白水解酶—枯草菌溶素）使组织酶解，释放出药物，不会发生乳化，对与蛋白结合牢固的药物可显著改善回收率。z缀合物水解缀合物主要是葡萄糖醛酸苷缀合物、硫酸酯缀合物、谷胱甘肽缀合物等。缀合物极性较大，难被有机溶剂提取，故需先进行水解。常用水解方法有：9酸水解：如HCl，作用强、快、专属性差9酶水解：常用葡萄糖醛酸苷酶或硫酸酯酶或该两种酶的混合酶。酶水解慢、专属、较温和提取纯化¾液-液提取（liquid-liquidextraction）多数药物为亲脂性，溶于适当的有机溶剂。并且大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质，因此液-液提取可以一次除去大部分杂质提取技术调节溶液pH值，使药物呈分子状态便于提取（1）碱性药物在碱性条件下提取，水相pH﹥药物pKa2～3单位（2）酸性药物在酸性条件下提取，水相pH﹤药物pKa2～3单位用与水不相混溶的有机溶剂提取。一般只提取一次，最常用的是乙醚和氯仿。影响提取的主要因素z水相pH值根据药物的酸碱性调节水相pH值z有机溶剂选择及与水相的体积比根据药物的脂溶性选择相应极性的有机溶剂z离子强度加中性盐，起盐析作用z乳化轻摇、选择合适溶剂对、调整溶剂比注意：z为减少内源性物质的干扰，在不影响提取率的情况下，尽量在偏碱性条件下提取，因为内源性物质大多是酸性的，在碱性条件下不易被有机溶剂提取。z极性大的药物不易被提取，可采用离子对提取法（ionpairextraction），常用的反离子有：测定碱性药物：用烷基磺酸类测定酸性药物：用烷基季铵类第三节定量分析方法特点¾容量分析法概念：一定浓度的滴定液由滴定管加到待测药物溶液中，按化学计量反应完全。根据滴定液浓度、体积及化学计量计算被测药物含量。关键问题：等当点的确定。滴定点——指示剂显示的滴定终点等当点——反应的化学计量点特点：操作简便、快速、实验条件易实现，但是灵敏度低，通常用于高含量和中含量药物含量的计算：z滴定度：1mL某物质的量浓度的滴定液相当于被测药物的重量，中国药典用mg表示。z滴定度的计算：aAbBT=CA××Mb滴定液被测药物z基于滴定度的百分含量计算：ab9直接滴定法含量％＝×100％实际工作中配制的滴定液浓度与药典中的规定浓度不一致，须引入滴定液浓度校正因子(f)f＝含量％＝×f×100％WVT×规定实际CCWVT×9回滴定法加入滴定液A与被测药物B完全反应，再以滴定液C回滴剩余的滴定液A（1）不做空白校正的百分含量计算：含量％＝×100％（2）做空白校正的百分含量计算：含量％＝×100％WTfVTfVBBBAAA××−××WTfVVBBB××−)(09含量测定•对照品比较法配制供试品溶液和对照品溶液，测定λ处吸收度C待测＝C对照×含量％＝×100％要求浓度与吸光度成正比，因此供试品与对照品溶液中的被测成分应尽可能一致。实际要求±10%•吸收系数法测定λ处吸收度，以该品种在规定条件下的吸收系数计算含量％＝×100％＝对照待测AAWVC×对照样品)()(%11%11cmcmEE样品)(%11cmEbCA•样品样品¾色谱分析法是一种分离分析方法介绍两种色谱分析方法：z高效液相色谱法（HPLC）9固定相、流动相及检测器的选择9系统适用性试验用规定的对照品对仪器进行试验和调整•色谱柱的理论塔板数(n)：n=5.54应高于规定的最小理论板数•重复性：样品连续进样5次，除另有规定外，峰面积相对标准偏差应不大于2.0%•拖尾因子(T)：T=除另有规定外，应在0.95～1.05之间。2)(2/hWtR105.02dWhd10.05hhW0.05htR9含量测定•内标加校正因子法：对照+内标样品+内标样品内标对照内标C样=f·A样/(A’内/C’内)校正因子f=(A内/C内)/(A对/C对)第四节药品质量标准分析方法验证一、目的证明所用的分析方法适合相应的检验要求（一）起草新药质量标准时（二）改变生产工艺时改变制剂处方修订原分