第03章 细胞生物学的研究方法

第三章细胞生物学的研究方法Chapter3Howcellsarestudied第四类研究方法第三类研究方法第二类研究方法CellV生化化学分析技术其它实验技术细胞生理学技术第一类研究方法形态观察技术第一节形态观察技术普通光镜特殊光镜形态观察扫描式电子显微镜扫描隧道电子显微镜透射式电子显微镜冰冻蚀刻技术紫外光显微镜暗视野显微镜相差显微镜微分干涉差显微镜荧光显微镜激光共聚焦显微镜光学显微镜电子显微镜目镜物镜集光器载物台光源1.普通光镜的结构:（一）普通光学显微镜一、光学显微镜第一节形态观察技术2.普通光镜的成像原理2图像样品光线聚光器物镜光学显微镜的光路图第一节形态观察技术移动臂蜡或树脂包埋的样品切片用钢刀样品切片蜡带伸展在盖玻片和载玻片之间的切片切片机(microtome):第一节形态观察技术在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状，不易看清。染色的原理往往将标本切片进行染色——提高可辨程度。第一节形态观察技术未染色已染色1.紫外光显微镜紫外线显微镜以紫外线(波长介于400nm与X射线之间)为光源，分辨率可提高1倍，可以看到许多在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。此外，核酸和有些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而这种显微镜可用来测定细胞核中的核酸含量。（二）特殊光学显微镜第一节形态观察技术然而，波长越短的紫外线越不易穿透普通玻璃，故必须用以特殊材料（如石英、萤石(CaF2)、碳酸锂等）制造的光学玻璃来制作显微镜透镜，造价较高。另外，紫外线显微镜还要求配置有照相装置，价格比较昂贵。第一节形态观察技术实用性较差2.暗视野显微镜这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。第一节形态观察技术中央遮光板暗视野聚光器的设计原理第一节形态观察技术视野的背景黑物体的边缘亮利用这种显微镜能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微镜高了40倍，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。3.相差显微镜荷兰物理学家F.Zernike(1932)：提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。获诺贝尔物理奖(1953)第一节形态观察技术(phasecontrastmicroscope)特点：在聚光器或光源上加了一环形光阑(annulardiaphragm),在物镜中加了一环形相板(annularphaseplate)。相差显微镜的构造:上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后1/4λ光程差。环形光阑环形相板使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。第一节形态观察技术相差显微镜的光路图解第一节形态观察技术根据设计，只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过。两组光线和轴后发生干涉现象。两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（正反差）——结构比周围介质更加变暗。未透过标本的直射光（通过相板环形区）与透过标本的偏折光（由相板其他部分通过）和轴后发生干涉：第一节形态观察技术S-DSD如果为凹形相板：通过样品的光线延后1/4λ-1/4λ-1/4λ则两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）——标本结构比周围介质更加变亮。第一节形态观察技术S+DSD如果为凸性相板：由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。-1/4λ+1/4λ4.微分干涉差显微镜Nomarski(1952)在相差显微镜原理的基础上发明的：又称Nomarski相差显微镜，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。第一节形态观察技术(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大。DIC显微镜首先DIC利用的是偏振光。此外，除了物镜外，还增加了四个光学组件：偏振器(polarizer)、DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器(analyzer)。DIC显微镜使细胞的细微结构立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。第一节形态观察技术DIC显微镜暗视野显微镜相差显微镜普通显微镜荧光显微镜的成象原理5.荧光显微镜第一节形态观察技术分裂细胞的免疫荧光图像不同荧光染料标记抗体抗原(细胞的蛋白质成分)特异性结合6.激光共聚焦显微镜第一节形态观察技术(LaserConfocalMicroscope,LCM)光源：♫通过共聚焦可进行光学切片♫对固相、液相物体均可进行观察特点：激光Q550MW型LCM4.冰冻蚀刻技术2.扫描式电子显微镜3.扫描隧道电子显微镜1.透射式电子显微镜二、电子显微镜第一节形态观察技术电镜问世的必然性分辨力的概念及其提高方法N.A.0.612λD分辨力(resolution)是指显微镜能将近邻的两个质点分辨清楚的能力，通常是用相邻两点间的距离来表示，可通过公式换算出：可见光波长为400~700nm，显微镜分辨率的最小数值不会小于0.2m，这一数值是光学显微镜分辨率的极限。2αinnN.A.s镜口率的大小决定于镜口角的大小和物镜与标本间介质折射率的大小第一节形态观察技术电镜问世的必然性限制显微镜分辨率的关键因素是光的波长，一般光学显微镜的最大放大倍数为1000~1500。小于0.2m的一些细微结构，称为亚显微结构(submicroscopicstructure)或超微结构(ultrastructure)，在光学显微镜下无法看清。要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。oD90sin68.110550612.030.2m放大倍数=显微镜的分辨率人肉眼的分辨率0.2m镜口率折射率光源波长(nm)第一节形态观察技术名称波长(nm)可见光760-390紫外光390-13X射线13-0.05γ射线1-0.005电子束:100V0.12310,000V0.0122100,000V0.00387表各种光及电子束的波长Ruska(1933~1938)便选择了电子束为光源来突破光学显微镜分辨率的极限，发明了透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)。电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。第一节形态观察技术V1λ电子显微镜与光镜的成像原理比较：第一节形态观察技术电子显微镜与光镜的主要区别电镜光镜电子束可见光电磁透镜玻璃透镜电磁聚焦机械聚焦超薄切片(0.05m)石蜡切片(1~10m)光源透镜聚焦方式切片厚度图像彩色图像黑白图像第一节形态观察技术由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机制作。电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍。1.透射电子显微镜超薄切片铜网第一节形态观察技术透射式电子显微镜(TEM)第一节形态观察技术它是将标本表面上发射出的次级电子，被带样电荷的栅极收集后，即向电子显象管发送信号，在荧光屏上显示出与电子束同步的扫描图像。图像为立体形象，反映了标本表面的真实结构。2.扫描电子显微镜用来观察标本的表面形态结构。第一节形态观察技术(scanningelectronmicroscope,SEM)扫描式电子显微镜第一节形态观察技术耳听毛的扫描电镜图像第一节形态观察技术3.扫描隧道显微镜其关键部件是有一个加上一定电压的精密探针，当探针接近物质时，由于‘隧道效应’而有电子飞出，从而在探针与物质之间有电流通过。Binnig、Rohrer等(1981)发明：荣获1986年诺贝尔奖！据量子力学中隧道效应设计，用来显示晶体表面原子布阵第一节形态观察技术(scanningtunnelingmicroscope,STM)当探针沿物质表面扫描时，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。将电流的这种改变图象化，即可显示出原子水平的凹凸形形态。探针物质第一节形态观察技术扫描隧道显微镜的分辨率很高（横向为0.1-0.2nm,纵向可达0.001nm）。扫描隧道显微镜能直接观察生物大分子(如DNA、RNA和蛋白质等)的原子布阵，也能观察一些生物结构(如生物膜、细胞壁等)的原子排列。在生物学研究中发挥着重要作用，将把生物学研究推进到纳米科学水平。其优越之处：三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察。第一节形态观察技术扫描隧道电子显微镜下金原子的晶格排列图像第一节形态观察技术亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。4.冰冻蚀刻技术冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。第一节形态观察技术(freeze-etching)①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。②然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构——蚀刻(etching)。蚀刻断裂(2)冰冻蚀刻技术的操作步骤:第一节形态观察技术③蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。复膜④复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。第一节形态观察技术(3)细胞冰冻断裂后的电镜图像第一节形态观察技术主要电镜制样技术小结电镜三维重构冷冻蚀刻和冷冻断裂负染技术超薄切片包埋切片固定染色扫描电镜技术第二节生物化学分析技术二、免疫细胞化学三、分子生物学定位技术四、放射自显影术五、超离心技术六、分子杂交技术七、PCR技术一、组织化学与细胞化学技术八、层析技术一、组织化学和细胞化学技术组织化学和细胞化学染色方法(histochemicalandcytochemicalstainingmethod)依据化学反应原理，对无色透明细胞的某些成分进行定性和定位研究。细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成份发生反应而着色的原理，从而得以对某种成份进行研究和分析。利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等。第二节生物化学分析技术最典型的组织化学显示法是Feulgen反应显示法(Feulgenreaction)。此法由Feulgen和Rossenbeck(1924)发明，对DNA的反应具有高度专一性。其原理是:标本经稀盐酸水解后，DNA分子中的嘌呤碱基被解离，从而在核糖的一端出现了醛基。Schiff试剂中的无色品红与醛基反应，形成含有醌基的化合物，醌基为发色团，呈现出紫红色。第二节生物化学分析技术免疫细胞化学是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原结合，对抗原进行专一定位测定的技术。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。二、免疫细胞化学(immunocytochemistry)第二节生物化学分析技术常用的标记物有荧光素和酶：标记荧光素的称为免疫荧光法(immunofluorescenttechnique)，常用的萤光素有异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明(rhodamine)等。标记酶的称为酶标免疫法(enzyme-labelledantibodymethod)，常用的酶有辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase)等，酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物或有色物，从而显示出抗原的存在部位。第二节生物化学分析技术抗体与抗原的结合方法可分为以下两种：第二节生物化学分析技术☺直接法☺间接法将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体与初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，增强显示效果间接免疫细胞化学法的原理示意图次级抗体初级抗体标记物第二节生物化学分析技术第一抗体（一抗）第二抗体（二抗）用荧光素标记抗体所显示出的细胞中几种蛋白质的分布状态第二节生物化学分析技术IRS-1IRS-1+Bcl-2