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流式检测细胞凋亡AnnexinV检测细胞凋亡........................................................................................2AnnexinV检测细胞凋亡实验原理................................................................................................................2实验用品................................................................................................................2操作步骤................................................................................................................3AnnexinVBlocking..............................................................................................5凋亡细胞的DNA断裂片段分析.............................................................................7DNA凋亡细胞的断裂片段分析实验原理................................................................................................................7实验用品................................................................................................................8操作步骤................................................................................................................9BrdUFlowKits检测细胞增殖..............................................................................12BrdUFlowKits检测细胞增殖实验原理..............................................................................................................12BrdUFlowKits试剂盒.......................................................................................12结果分析..............................................................................................................17流式仪器设置指南..............................................................................................18线粒体膜电位变化检测细胞凋亡..........................................................................22线粒体膜电位变化检测细胞凋亡实验原理..............................................................................................................22实验用品..............................................................................................................22样本制备..............................................................................................................23结果分析..............................................................................................................24注意事项..............................................................................................................24ActiveCaspase-3检测细胞凋亡...........................................................................26ActiveCaspase-3检测细胞凋亡实验原理..............................................................................................................26实验步骤..............................................................................................................27结果分析..............................................................................................................281AAnnnneexxiinnVV检检测测细细胞胞凋凋亡亡实验原理AnnexinV是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时昀早的改变之一。在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS)由质膜内侧翻向外侧。AnnexinV与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA碎片检测比较，使用AnnexinV可以更早地检测到凋亡细胞。因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以AnnexinV常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(AnnexinV+/核酸染料-)与死亡细胞(AnnexinV+/核酸染料+)。实验用品1.一次性12×75mmFalcon试管。2.PBS缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8°C保存。3.微量加样器和加样头。24.AnnexinVBindingBuffer缓冲液（Cat.No.66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。5.AnnexinV试剂与核酸染料：AnnexinV核酸染料AnnexinV-Biotin（Cat.No.65872X）Streptavidin-FITC（Cat.No.13024D）PI（Cat.No.66211E）或7-AAD（Cat.No.34321X）AnnexinV-FITC（Cat.No.65874X）PI（Cat.No.66211E）AnnexinV-PE（Cat.No.65875X）7-AAD（Cat.No.34321X）6.FACS流式细胞仪：上样检测。7.CELLQuest软件：获取和分析试验数据。8.AnnexinV检测对照管：AnnexinVA-阴性对照B-补偿1C-补偿2BiotinSAv-FITCAnnexinV-Biotin和SAv-FITCPI和SAv-FITCPE未染色细胞AnnexinV-PE7-AADFITC未染色细胞AnnexinV-FITCPI操作步骤1.取Falcon试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。2.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1×BindingBuffer缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。3.Falcon试管中加入100µl细胞悬液。4.按以下体积加入AnnexinV与核酸染料：管号名称荧光标记AnnexinV核酸染料：1阴性对照--2单阳1AV-FITC-3单阳2-PI4样本AV-FITCPI5.轻轻混匀，室温（20°C~25°C）避光处放置15分钟。36.*使用AnnexinV-Biotin试剂进行检测时：h1×BindingBuffer缓冲液洗细胞一次，去上清。h1×BindingBuffer缓冲液100µl溶解SAv-FITC试剂0.5µg，加入到细胞管中。h轻轻混匀。h加入5µlPI，室温（20-25°C）避光处放置15分钟。7.各试验管中分别加入1×BindingBuffer缓冲液400µl。8.1小时内上流式细胞仪测定结果。结果分析：以下4个样本分别是阴性对照、AnnexinV单阳管、PI单阳管和试验管。100101102103104FL1-Height1.001100101102103104Annexin1.002100101102103104FL1-Height1.003100101102103104Annexin1.0044AnnexinVBlocking待测细胞与未标记的重组AnnexinV预孵育，然后进行实验，是AnnexinV细胞凋亡检测的质量控制。原理是预先阻断AnnexinV-FITC的结合位点，这样可以证明AnnexinV-FITC凋亡分析的特异性。1.使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1×BindingBuffer缓冲液制成1×106细胞/ml的悬液。2.在5ml的培养管中加入100µl细胞悬液（约1×105个细胞）。3.加入5-15µg纯化的重组AnnexinV。注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其AnnexinV位点饱和所需要的纯化的重组AnnexinV含量不同。某些情况下，为达到昀好效果，可以减少细胞数量，0.5×105个细胞加5-15µg纯化的重组AnnexinV。4.轻轻混匀，室温反应15分钟。5.加入5µl的AnnexinV-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。6.各试验管中分别加入1×BindingBuffer缓冲液400µl。7.1小时内上流式细胞仪测定结果。8.结果分析：下图A、B为Anti-Fas抗体诱导3小时后的JurkatT细胞,图C、D为未处理的细胞；图A、C为AnnexinV-FITC染色的凋亡检测结果，图B、D为AnnexinVBlocking后的检测结果。5PharMingen推荐AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒规格货号AnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitI:PartA：AnnexinV-FITC(100tests)PI(2ml)1×BindingBuffer缓冲液(50ml)100tests6693KKAnnexinV-FITCApoptosisDetectionKitII(AnnexinVBlocking):PartA：AnnexinV-FITC(100tests)PI(