RNA

2020/1/29RNA预防医学1301班第二组2020/1/29基本内容人类细胞质RNA提取RT-PCR的原理、方法琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用2020/1/29提取原理操作步骤逆转录原理操作步骤提取总RNA合成cDNA第一链原理体系引物选择PCR电泳原理电泳步骤电泳提取原理操作步骤逆转录原理操作步骤提取总RNA合成cDNA第一链原理体系引物选择PCR电泳原理电泳步骤电泳2020/1/29人类细胞质RNA提取RNA的提取准备试剂：氯仿，异丙醇，75℅乙醇，无RNase的水或0.5℅SDS(溶液均需用DEPC处理过的水配制)2020/1/29人类细胞质RNA提取操作步骤:1.匀浆处理:a.组织将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理。样品体积不应超过TRIzol体积10℅。b.单层培养细胞直接在培养板中加入TRIzol裂解细胞，每10cm2面积(即3.5cm直径的培养板)加1ml，用移液器吸打几次。TRIzol的用量应根据培养板面积而定，不取决于细胞数。TRIzol加量不足可能导致提取的RNA有DNA污染。c．细胞悬液离心收集细胞，每5-10×106动物、植物、酵母细胞或1×107细菌细胞加入1mlTRIzol，反复吸打。加TRIzol之前不要洗涤细胞以免mRNA降解。一些酵母和细菌细胞需用匀浆仪处理。2．将匀浆样品在室温（15-30℃）放置5分钟，使核酸蛋白复合物完全分离。3．可选步骤：如样品中含有较多蛋白质，脂肪，多糖或胞外物质（肌肉，植物结节部分等）可于2-8℃10000×g离心10分钟，取上清。离心得到的沉淀中包括细胞外膜，多糖，高分子量DNA，上清中含有RNA。处理脂肪组织时，上层有大量油脂应去除。取澄清的匀浆液进行下一步操作。2020/1/29人类细胞质RNA提取4.每使用1mlTRIzol加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。5.2-8℃10000×g离心15分钟。样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60℅。6.把水相转移到新管中，如要分离DNA和蛋白质可保留有机相，进一步操作见后。用异丙醇沉淀水相中的RNA。每使用1mlTRIzol加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟。7.2-8℃10000×g离心10分钟，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。移去上清。8.用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。每使用1mlTRIzol至少加1ml75℅乙醇。2-8℃不超过7500×g离心5分钟，弃上清。9.室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟即可.不要真空离心干燥，过于干燥会导致RNA的溶解性大大降低。加入25-200μl无RNase的水或0.5℅SDS,用枪头吸打几次,55-60℃放置10分钟使RNA溶解.如RNA用于酶切反应,勿使用SDS溶液。RNA也可用100℅的去离子甲酰胺溶解，-70℃保存。2020/1/29人类细胞质RNA提取注意事项：1.从少量样品（1-10mg组织或102-104细胞）中提取RNA时可加入少许糖原以促进RNA沉淀。例如加800mlTRIzol匀浆样品，沉淀RNA前加5-10μgRNase-free糖原。糖原会与RNA一同沉淀出来，糖原浓度不高于4mg/ml是不影响第一链的合成，也不影响PCR反应。2．匀浆后加氯仿之前样品可以在-60至-70℃保存至少一个月。RNA沉淀可以保存于75%酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。3．分层和RNA沉淀时也可使用台式离心机，2600×g离心30-60分钟。预期产量：1mg组织或1×106细胞提取RNA分别为：肝和脾6-10μg,肾3-4μg,骨骼肌和脑组织1-1.5μg,胎盘1-4μg,上皮细胞8-15μg,成纤维细胞5-7μg。2020/1/29人类细胞质RNA提取所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点：1.样品细胞或组织的有效破碎；2.有效地使核蛋白复合体变性；3.对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；4.有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5.对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。2020/1/29人类细胞质RNA提取RNA酶可耐受多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。2020/1/29人类细胞质RNA提取1.塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。2.有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。3..所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6h或更长时间。4.配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37℃处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。5.操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。6.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。2020/1/29人类细胞质RNA提取若两条带不明显,则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。完整的RNA的电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。2020/1/29人类细胞质RNA提取A.组织取出后没有马上处理或冷冻。RNA降解B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70℃，而保存在了-5至-20℃。C.细胞在用胰酶处理时过度。D.溶液或离心管未经RNase去除处理。E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染A.样品匀浆时加的试剂量太少B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液2020/1/29低得率A．样品裂解或匀浆处理不彻底B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。B．样品匀浆时加的试剂量太少。C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。D．水相中混有有机相。E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A．组织取出后没有马上处理或冷冻B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-70℃保存。C．细胞在胰酶处理时被破坏。D．溶液或离心管未经RNase去除处理。2020/1/29RT-PCR的原理、方法原理1、基因表达：DNARNAProtein单拷贝基因表达存在逐步放大机制，如一个蚕丝心蛋白基因104个丝心蛋白mRNA（每个mRNA存活4d，可以合成105个丝心蛋白）共合成109个丝心蛋白。因此单拷贝基因的mRNA表达水平对于其功能水平的调控是非常重要的。2、PCR技术(olymerasechainreaction)：即聚合酶链式反应。在模板、引物和四种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于DNA聚合酶的酶促反应，其特异性由两个人工合成的引物序列决定。反应分三步：A、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，形成单链DNA；B、退火：将反应混合液冷却至某一温度，使引物与模板结合。C、延伸：在DNA聚合酶和dNTPs及Mg2＋存在下，退火引物沿5‘3’方向延伸。以上三步为一个循环，如此反复。3、逆转录酶和RT-PCR逆转录酶（reversetranscriptase）是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶，至少具有以下三种活性：1、依赖RNA的DNA聚合酶活性：以RNA为模板合成cDNA第一条链；2、Rnase水解活性：水解RNANA杂合体中的RNA；3、依赖DNA的DNA聚合酶活性：以第一条DNA链为模板合成互补的双链cDNA.2020/1/29RT-PCR的原理、方法方法二、RT-PCR的准备：1、引物的设计及其原则：1）引物的特异性决定PCR反应特异性。因此引物设计是否合理对于整个实验有着至关重要的影响。在引物设计时要充分考虑到可能存在的同源序列，同种蛋白的不同亚型，不同的mRNA剪切方式以及可能存在的hnRNA对引物的特异性的影响。尽量选择覆盖相连两个内含子的引物，或者在目的蛋白表达过程中特异存在而在其他亚型中不存在的内含子。2）引物设计原则的把握：引物设计原则包括a、引物长度:一般为15～30bp，引物太短会影响PCR的特异性，引物太长PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最适温度，也影响反应的特异性。b、碱基分布：四种碱基最好应随机分布，避免嘌呤或嘧啶的聚集存在，特别是连续出现3个以上的单一碱基。GC含量（Tm值）：40％～60％，PCR扩增的复性温度一般是较低Tm值减去5～10度。2020/1/29RT-PCR的原理、方法RT-PCR引物的选择随机引物适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。OligodT适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的OligodTrRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于OligodT要结合到PolyA尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也会使全长cDNA合成量大大减少。基因特异性引物与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。天为时性引物代公司的SuperScriptOne-StepSystem特别适合于与基因特异性引物连用。PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。2020/1/29RT-PCR的原理、方法2、耗材：实验所用的接触样品的耗材如冻存管、枪头、EP管之类事先都需经过0.1%DEPC水浸泡处理，除去RNA酶，防止操作过程中RNA降解。然后经高压灭活（灭菌和灭活DEPC）。3、试剂准备：变性液、水饱和酚、乙酸钠、氯仿、异丙醇、75%酒精、经DEPC处理并高压的水。2020/1/29RT-PCR的原理、方法c、3‘端要求：3’端必须与模板严格互补，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。末位碱基是A时错配的引发效率最低，G、C居中间，因此引物的3’端最好选用A、G、C而尽可能避免连续出现两个以上的T。d、引物自身二级结构：引物自身不应存在互补序列，否则会自身折叠成发夹状结构或引物自身复性。e、引物之间的二级结构：两引物之间不应有多于4个连续碱基互补，3’端不应超过2个。f、同源序列：引物与非特异扩增序列的同源性应小于连续8个的互补碱基存在。g、5’端无严格限制：5’末端碱基可以游离，但最好是G或C，使PCR产物的末端结合稳定。还可以进行特异修饰（标记、酶切位点等）等等。根据实验目的选择适当的引物。常用引物设计软件如Primer5.0，Oligo6.0等对于这些条件都可以自行设置。2020/1/29RT-PCR的原理、方法三、RNA的提取方法：RT－PCR中从细胞分离的RNA的质量至关重要，包括RNA的纯度和完整性。RNA分离的最关键因素是尽量减少RNA酶的污染。但RNA酶活性非常稳定，分布广泛，除细胞内源性RNA酶外，环境中也存在大量RNA酶。因此在提取RNA时，应尽量创造一个无RNA酶的环境，包括去除外源性RNA酶污染和抑制内源性RNA酶活性，主要是采用焦碳酸二乙酯（DEPC）去除外源性RNA酶，通过RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和强力的蛋白质变性剂如异硫氰酸胍抑制内源性RNA酶。2020/1/29RT-PCR的原理、方法2020/1/29RT-PCR的原理、方法2020/1/29RT-PCR的原理、方法2020/1/29琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用凝胶准备胶床准备铺胶静置胶床置于电泳槽中加电泳缓冲液拔梳子上样电泳取出凝胶拍照2020/1/29琼脂糖凝胶电泳结果分析及