RNAi-回顾

RNAi——回顾摘要：生物通技术特刊：RNAi技术专辑之一：RNAi的回顾（生物通编译）近年来的研究表明,一些小的双链RNA可以高效、特异的阻断体内特定基因表达，促使mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAinterference，RNAi，也译作RNA干预或者干涉）。它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。由于可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，可以毫不夸张的说，RNAi正在功能基因组学领域掀起一场真正的革命，并将彻底改变这个领域的研究步伐。为此被Science评为2001年最重要的的成果之一。......前言转录后基因沉默（Post-transcriptionalgenesilencing，PTGS),原来曾经一度被认为是矮牵牛和少数几种植物的特殊现象，如今已成为分子生物学领域最热门的研究课题之一了(1)。在过去的几年中，研究表明这种现象在植物和动物中都会发生，并且参与抵抗病毒感染、转座子沉默机制（transposonsilencingmechanisms）等过程。其中最引人注意的，就是RNA干扰（RNAinterference,RNAi，也有译作RNA干预或者干涉）——引入双链RNA（dsRNA），通过特异性结合互补链从而抑制基因的表达，或者说是通过双链RNA引发转录后沉默，从而作为一种抑制细胞中某个基因表达的有力工具。(reviewedin1-3).RNAi是如何被发现的？以怎样一种机制工作？更重要的是如何利用这项强大的技术进行功能基因组的研究？本文将概要的介绍并将提供大家一些相关的资料。20多年前，在对矮牵牛（petunias）进行的研究中有个奇怪的发现：RichJorgensen和同事将一个能产生色素的基因置于一个强启动子后，导入矮脚牵牛中，试图加深花朵的紫颜色，结果没看到期待中的深紫色花朵，多数花成了花斑的甚至白的。Jorgensen将将这种现象命名为协同抑制cosuppression，因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。(1-5).开始这被认为是矮牵牛的特有的怪现象，后来发现在其他许多植物中，甚至在真菌中也有类似的现象，特别是在脉孢霉Neurospora中进行了详细的研究(在这里被称为quelling）(1-3)。然而是什么原因导致这种基因沉默的现象呢？尽管对于部分植物来说，转基因引发的基因沉默可能是因为基因特异的甲基化而导致，这被称为转录阶段基因沉默（transcriptionalgenesilencing,orTGS)，但是，确实有部分的植物中的基因沉默是在转录后发生的，称为post-transcriptionalgenesilencing,orPTGS)。实验（Nuclearrun-onexperiments）表明同源转录本确实有出现，但是很快在胞浆中被降解，没有积聚(1,3,6)。转基因会引发PTGS，然而silencing也可能被一些病毒诱发(2,3)。一旦被引发，PTGS由一种可扩散的反式作用分子介导。这首先在脉孢霉Neurospora中得到证实：Cogoni和他的同事发现基因沉默可以在异核体的细胞核之间传递(1,7)。后来Palauqui和同事进一步证实，在植物中，将出现转基因导致基因沉默的植物嫁接到另一没有基因沉默的植物中，同样可以导致PTGS。在后来线虫和果蝇的实验中我们知道导致植物中的PTGS的反式作用因子是双链RNA(1-3)RNAi是在线虫中发现的。首次发现dsRNA能够导致基因沉默的线索来源于线虫Caenorhabditiselegans的研究。7年前（1995）康乃尔大学的研究人员Guo和Kemphues尝试用反义RNA去阻断par-1基因的表达以探讨该基因的功能，结果反义RNA的确能够阻断par-1基因的表达，但是奇怪的是，注入正义链RNA作为对照，也同样阻断了基因的表达(9)。这个奇怪的现象直到3年后才被解开——华盛顿卡耐基研究院的AndrewFire和马萨诸塞大学癌症中心的CraigMello首次将dsRNA——正义链和反义链的混合物注入线虫，结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因Silencing。实际上每个细胞只要很少几个分子的dsRNA已经足够完全阻断同源基因的表达。后来的实验表明在线虫消化道中注入双链RNA不单可以阻断整个线虫的同源基因表达，还会导致其第一代子代的同源基因沉默。他们将这种现象称为RNA干扰（RNAinterference,简称RNAi，10）RNAi潜在的作用促使Fire和Timmons继续实验，将能够表达与C.elegansunc-22基因同源的dsRNA的细菌喂食线虫，结果线虫表现出类似unc-22缺陷的表型（11—13）。后继的实验表明将线虫浸入dsRNA中同样可以诱导基因沉默——这种技术使得大规模筛选线虫RNAi诱导的功能缺失突变体成为可能，并引发后继的大量针对这种模式生物基因敲除的研究。果蝇中的RNAi在果蝇的研究中同样发现RNAi。尽管采用能生产dsRNA的酵母喂食果蝇的实验失败告终，但是通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中、或者将带有反向重复序列的DNA导入果蝇中能够引发基因沉默。在过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具，用于鉴定功能缺失表型。（19—23）注射的RNAi如何引发基因沉默？在过去的数年中多个研究小组进行了不懈的努力。Baulcombe和Hamilton首先在发生协同抑制的植物中鉴定了一些在没有发生基因沉默的植物中并不存在的大约25个碱基大小的RNA，这些RNA分别与沉默基因的正义和反义链互补(24)。这成为揭示RNAi秘密的第一条关键线索。后来在果蝇细胞中的实验进一步揭示这个秘密(3,25,26)。在一系列著名的实验中，Zamore和同事发现注入果蝇细胞的dsRNA被切割为21—23碱基长短的RNA片段，他们同时发现：与dsRNA同源的内源基因的mRNA，只在和dsRNA对应的部位被切割成为21—23核苷酸长的片断(26)。很快，RNAi的机制越来越清楚了。现有的RNAi机制的模型通过生化和遗传学研究，产生了现有的RNAi作用机制模型，包括起始阶段和效应阶段(initiationandeffectorsteps，27,点击看看Flash演示动画HowDoesRNAiWork?)。在起始步骤，加入的dsRNA被切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段（smallinterferingRNAs，siRNAs，又被称为引导RNAs：guideRNAs3,18,27），证据表明：一个称为Dicer的酶，是RNaseIII家族中特异识别双链RNA的一员，能以一种ATP依赖的方式逐步（processive）切割由外源导入或者由转基因、病毒感染等各种方式引入的双链RNA，切割将RNA降解为19—21bp的双链RNAs(siRNAs)，每个片断的3’端都有2个碱基突出(27,28)。在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-inducedsilencingcomplex,orRISC）。激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上，并在距离siRNA3’端12个碱基的位置切割mRNA(3,18,27,29)。尽管切割的精确机制现在还是未知，研究表明每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。由于在一些生物中RNAi的影响格外显著，有人提出在RNAi途径中可能存在某个（信号）扩增的步骤。这种扩增可能是复制外源注入的dsRNA从而产生更多的siRNA，也可能是直接扩增siRNA本身(参见下一段文字)。这种扩增可能在RNA诱导沉默复合物（RISC）形成过程进行，作为RISC形成的补充，或者独立于RISC(3,18,27)。RNA依赖的RNA聚合酶的潜在作用对脉胞菌、线虫和拟南芥的基因筛查过程中鉴定了几个显然对转录后基因沉默（PTGS）和RNAi过程起关键作用的基因。其中包括Neurosporaqde-1,ArabidopsisSDE-1/SGS-2和C.elegansego-1在内的几个基因，都是编码RNA依赖的RNA聚合酶（RNA-dependentRNApolymerases，RdRPs)的。初步的结论，很可能就会推断这是“RNA依赖的RNA聚合酶活性是RNAi所必须的”证据。当然，如果真的存在聚合酶扩增dsRNA或者siRNA这一步的话，RNA依赖的RNA聚合酶的存在就有助于解释何以dsRNA诱导基因沉默有如此强大作用。但是这些基因的突变体有不同的表型，这使得在RNAi过程中RNA依赖的RNA聚合酶的作用难以确定(1,3,17,18)。线虫C.elegansego-1（ego代表enhancerofglp-1）突变体中，RNAi在肌肉细胞中正常出现，但在生殖系细胞中，也就是ego-1主要表达的地方，RNAi没有发生。在拟南芥ArabidopsisSDE-1/SGS-2(SGS代表suppressorofgenesilencing)突变体中，通过内源复制的RNA病毒引入dsRNA可以产生siRNA，但是通过转基因引入的dsRNA则不会产生siRNA。有人推断说可能是病毒本身的RNA依赖的RNA聚合酶（RdRP）取代了拟南芥突变体中的这些酶(1,3,17,18)。虽然在果蝇和人类体内还未发现RdRP的类似物，近来的一篇文章报道了在果蝇胚胎细胞中发现RdRP活性(30)。一种称为随机降解PCRrandomdegradativePCR的模型认为：RdRP以siRNA为引物扩增模版mRNA，产生dsRNA底物提供给Dicer酶，结果产生更多的siRNA。在线虫的实验中找到了支持这种模型的证据(27,30)，但是同样在果蝇胚胎细胞的实验结果则反驳了这种理论模型(26,27)。RNAi的起始两个线虫基因，rde-1和rde-4(rde代表RNAideficient)据信是参与RNAi的起始步骤。这些基因的突变体线虫即使注入dsRNA也不会出现基因沉默，但是如果没有沉默缺陷的杂和亲代将siRNA传递到这种突变体中则会引发基因沉默。线虫rde-1基因属于一个大的基因家族，和脉胞菌qde-2(qde代表quellingdeficient)、拟南芥ago1基因(ago代表argonaute，早前被鉴定参与拟南芥的发育）同源，尽管这些基因在转录后基因沉默（PTGS）中的作用不明，RDE-1家族在哺乳动物中的一个成员已经被证实是一个翻译起始因子。有趣的是拟南芥中的AGO1突变体表现为协同抑制缺陷的同时也表现为叶发育缺陷。所以，PTGS相关的一些酶或者过程可能参与发育过程(1,3,17,18)。RNAi的效应物转录后基因沉默（PTGS）的效应步骤的重要基因包括线虫rde-2和mut-7基因。这些基因首先是在一种杂和突变体线虫中发现的，这种杂和突变体不能将RNAi传递给他们的纯和子代。有这两个基因突变的线虫表现为RNAi缺陷，但是引人注意的是他们同时表现出转座子活性提高。因此保持转座子沉默的某种机制看来与RNAi和PTGS相关。尽管rde-2基因产物还未经识别，mut-7编码的蛋白有着和RNaseD的核酸酶结构域同源的区域，以及一个人类Werner综合症（一种快速老化的疾病）中出现的蛋白的同源区域(1,3,17,18,31)。这个蛋白有可能是降解靶RNA所需要的核酸酶。PTGS有着古老的根源从遗传和生化的角度分别进行的研究同样指出转录后基因沉默（PTGS）可能在生命进化的早期就存在。有人提出转录后基因沉默可能是进化过程中一种抵御转座子或RNA病毒的防御机制，可能在植物和动物分化之前就已经出现(1,3,17,18)。有趣的是，许多研究人员都注意到：破坏RNAi相关的基因通常导致严重的发育缺陷，这个发现提示RNAi与至少一个发育过程有着某种联系。一组小分子RNA，就是smalltemporalRNAs(stRN