RNA基本操作技术

RNA基本操作技术•真核生物的基因组DNA非常庞大，而且含有大量的重复序列，无论用电泳分离技术还是用杂交方法度难以分离到靶基因片段。而cDNA则来自反转录的mRNA，不带有多余序列，通过特异性探针筛选cDNA文库，可以较快的分离到相关基因。RNA基本操作技术•1.总DNA的提取•2.mRNA的纯化•3.cDNA的合成•4.cDNA文库的构建•5.基因文库的筛选1.总RNA的提取•1.1RNA的种类及特点•总RNA包括mRNA,rRNA,tRNA以及一些小RNA（sRNA）。一个典型的动物细胞中，80%-85%为rRNA、15%-20%为tRNA及sRNA，mRNA约占总RNA的1%-5%。•rRNA电泳后的三条特征性条28S、18S和5S是鉴定总RNA纯度和完整性的重要参数。•mRNA呈单链状，易受核酸酶的攻击，操作时必须保证实验环境、所用器皿及溶液均无RNA酶的污染。1.2总RNA的提取方法•1.2.1Trizol法•原理：Trizol试剂使用最广泛的抽提RNA的专用试剂，主要由苯酚和异硫氰酸瓜组成可以迅速破坏细胞结构，使存在于细胞质及核内的RNA释放出来并使核糖体蛋白与RNA分离，还能保证RNA的完整性。1.2总RNA的提取方法•提取步骤•1.用液氮研磨材料，匀浆加入Trizol试剂，进一步破碎细胞并溶解细胞成分。•2.加入氯仿抽提，离心，分离水相和无机相，收集含RNA的水相。•3.用异丙醇沉淀，漂洗溶解。1.2总RNA的提取方法•1.2.2普通离心柱法•原理:含有目的RNA的细胞破碎液通过该柱时，硅胶模对RNA的吸附，使RNA与其他成分分开，在低盐浓度下可从硅胶模上直接洗脱。1.2总RNA的提取方法•1.2.3氧化锂法•基本原理：采用高浓度尿素变性蛋白，并抑制RNA酶，用氯化锂选择沉淀RNA。本法特别适用于从大量样品中提取少量组织RNA，并具有快速简捷的长处，但也存在少量DNA的污染及RNA得率不高、小RNA片段丢失的缺陷。1.2总RNA的提取方法•提取步骤•1.对大量组织或细胞，加入氧化锂-尿素溶液，匀浆器高速匀浆。•2.匀浆液在0-4℃,静置，离心•3.取沉淀加入氧化锂-尿素溶液，重复步骤2•4.加入等体积酚：氯仿：异戊醇，室温静置，离心。•5.取上层水相，加乙酸钠-20℃静置，离心。•6.70%乙醇沉淀，真空干燥。•7.RNA溶解液溶解沉淀，-70℃保存。1.2总RNA的提取方法•1.2.4用N-P40法•基本原理：细胞置于低渗透压下，从外界环境吸水而膨胀，处于易裂解状态。利用表面活性剂乙基苯基聚乙二醇（N-P40）使细胞膜的通透性增强，从而使细胞裂解。1.2总RNA的提取方法•提取步骤•1.细胞（或组织粉末）中加裂解缓冲液（VRC），吹打，冰上静置。•2.加NP-40，搅拌，离心，加蛋白酶缓K冲液。•3.离心，取上清，加蛋白酶K缓冲液,混匀，37℃保温。•4.加酚，搅拌混匀，室温，离心，取上清。•5.加酚：氯仿：异戊醇搅拌，室温，离心，按3,4步再抽提一次。•6.取上清，加NaAc和异丙醇，-70℃静置。•7.离心，弃上清，沉淀用80%乙醇漂洗，离心。•8.弃上清，干燥沉淀，溶解沉淀。1.2总RNA的提取方法•1.2.3植物组织中RNA的提取方法1.3RNA浓度和纯度的测定•1.31通过测定其OD260和OD280来判断。•OD260为1时相当于浓度为4㎎/ml。•如果OD260/OD280在1.8-2.0，表示所提取的RNA纯度较好。•如果OD260/OD280明显低于1.8，表示样品中可能有蛋白质或酚污染。1.3RNA浓度和纯度的测定•1.3.2通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA。•电泳后如果rRNA大小完整，而且28SrRNA和18SrRNA亮度接近2:1，mRNA