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生物技术制药3基因工程制药3.1.4基因工程菌发酵培养与控制工程菌的培养特点工程菌的大规模培养终点控制生产安全3.1.4.1基因工程菌的培养特点对菌体生长的调控主要有两种观点：•能量的供应决定了菌体的最大比生长速率；•小分子前体和催化组分等等的限制决定了菌体的最大比生长速率。一、菌体生长与能量的关系当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体往往会产生代谢副产物乙酸。高浓度的乙酸能明显抑制菌体的生长。解决方法：选用不同的碳源、控制补料速度、连续培养中控制稀释速率等培养方法，都能在一定范围内控制菌体的生长，从而控制乙酸的产生。实质：控制菌体的糖酵解速度，避免乙酰辅酶A的积累和乙酸的产生，以降低供能速度或前体供应速度来降低蛋白合成和菌体生长速度。二、菌体生长与前体供应的关系细胞竞争共同的前体和催化结构，使在同样的培养基中，工程菌的比生长速率往往低于其宿主细胞，特别是工程菌诱导后，由于外源基因的大量表达，引起菌体比生长速率下降，甚至生长停滞。工程菌的培养控制质粒稳定性重组质粒拷贝数的控制及表达效率3.1.4.2基因工程菌的大规模培养基因工程菌的培养过程主要包括：（1）通过摇瓶操作了解工程菌生长的基础条件，如温度、pH、培养基各种组分以及碳氮比，分析表达产物的合成、积累对受体细胞的影响；（2）通过培养罐操作确定培养参数和控制的方案以及顺序。生产特点工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室规模低。应提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物向细胞外分泌。工程菌的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生一些抑制细胞生长的代谢物。培养方式基因工程细胞的培养过程与一般需氧细胞培养基本一致，培养方式亦无差异，可采用分批培养方式，亦可采用连续培养、半连续培养及透析培养等方式。高密度发酵补料调控重组大肠杆菌高密度发酵成败的关键是补料和诱导策略。合理流加使葡萄糖保持在一定的水平可降低葡萄糖效应。恒速流加:比生长速率降低,菌体量线性上升。变速流加:在菌体密度高时，通过加入更多的营养物质促进细胞生长并对表达有利。指数流加补料:补料速度呈指数上升,比生长速率恒定,可控制基质浓度在较低的水平,减少乙酸生成,应用较广。一、工程菌的培养控制1底物浓度的控制基因工程菌培养至少要遵循P1级物理防护的规定，必需进行菌体的高密度培养。基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。维生素可在培养开始即加入，氨基酸可在调节pH值同时补加氨基酸混合物和葡萄糖的方法。培养基组成与控制(1)碳源大肠杆菌：蛋白胨等蛋白质的降解物作为碳源。酵母：利用葡萄糖、半乳糖等单糖类物质。添加低浓度的单糖和双糖及其他有机物如甘油等，对菌体生长具有一定的促进作用。例：胡志明等利用M9复合培养基,以甘油为碳源进行连续流加，使重组人血管内皮细胞生长因子表达量达到23%。KlemanGL等的研究表明，重组大肠杆菌W3100在葡萄糖浓度为0.5g/L，pH6.0的培养基中,乙酸6g/L，而pH7.5时为12g/L。(2)氮源直接很好地吸收利用铵盐等，一般不能利用硝态氮。几乎都能利用有机氮源。不同工程菌对氮源利用能力差异很大，具有很高的选择性。大肠杆菌：利用大分子有机氮源，酵母粉等。酵母：利用氨基酸为氮源。(3)无机盐磷、硫、钾、钙、镁、钠等大量元素和铁、铜、锌、锰、钼等微量元素的盐离子形态。(4)选择剂维持工程菌的纯正性和质粒的稳定性的化合物。根据质粒上的营养缺陷或选择性标记基因，添加缺陷选择剂。选择剂种类营养缺陷互补和抗生素抗性。工程大肠杆菌：卡那霉素、氨苄青霉素、氯霉素、博来霉素等抗生素。工程酵母菌：氨基酸营养缺陷型，缺陷亮氨酸、组氨酸、赖氨酸、色氨酸等。(5)诱导物诱导表达型工程菌：在细胞生长到一定阶段，必需添加诱导物，以解除目标基因的抑制状态，活化基因，进行转录和翻译，生成产物。Lac启动子表达系统：IPTG诱导。甲基营养型酵母：加入甲醇进行诱导。(6)培养基组成对质粒稳定性的影响营养较丰富的培养基较合成培养基内质粒稳定性高。培养基中添加酵母提取物和谷氨酸等有利于提高质粒稳定性。限制性基质对基因工程菌的比生长速率有不同影响。大肠杆菌对葡萄糖和磷酸盐限制易发生质粒不稳定，有一些质粒对氮源、钾、硫等表现不稳定。对于酵母，极限培养基比丰富培养基更有利于维持质粒稳定性。2培养工艺与控制温度对工程菌发酵的影响大肠杆菌和酿酒酵母最低温度为10℃大肠杆菌最适温度37℃，最高温度45℃。酿酒酵母最适温度30℃，最高温度40℃。较高温度表达包涵体，较低温度有利于表达可溶性蛋白质。对于热敏感的蛋白质，生产期可采用先高温，然后低温，变温表达，避免蛋白质降解。温度控制两段变温发酵培养：前期：较高温度发酵，获得足够高的菌体密度；后期：较低温培养，对合成目标产物的抑制不明显，但可有效抑制目标产物的降解和包涵体形成。温度诱导型大肠杆菌表达系统：生长期维持37℃，生产期提高温度至42℃。pH值对发酵的影响大肠杆菌适宜pH为6.5～7.5，酵母适宜pH为5.0～6.0。干扰素在酸性条件下稳定，而在碱性条件下容易降解。酸性环境有利于发挥菌株生产能力。乙酸的产生使菌体生长速率下降，也抑制基因表达。溶解氧控制控制溶氧浓度的措施主要有改变发酵通气量、搅拌速度和罐压。•通气量大，转速高溶氧也高。但泡沫增多，使发酵罐的有效利用降低。•增加罐压可以提高氧分压,但是二氧化碳的分压也提高，可采用在通入的空气中掺入纯氧来提高氧分压。•溶氧可作为发酵终点的判断依据之一，在菌体生长旺盛期溶氧下降，细菌生长稳定期溶氧曲线平稳，衰老期溶氧曲线上升且趋于平稳，这时可终止发酵。例：DeLeonA等研究了溶氧对大肠杆菌JM101分批发酵中青霉素酰化酶生产的影响。溶氧水平为1%时，青霉素酰化酶的活性和比活都达到最大，当溶氧由1%增加到10%时，青霉素酰化酶的活性和比活都下降，当溶氧继续升高，青霉素酰化酶的活性变化不大。二、质粒稳定性质粒不稳定的类型分离性不稳定细胞分裂过程中质粒缺失，分配到子细胞中时导致整个质粒丢失。结构性不稳定由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。1分离丢失当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离丢失。低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等的分配。对于高拷贝质粒，形成无质粒细胞的可能性低（每百万细胞分裂中一个）。大反应器总会存在无质粒细胞。例如1000L发酵液，每毫升有109个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应器中就含有109个无质粒细胞。质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。许多质粒会形成多聚体，即相同质粒附着在一起形成一个单位。1分离丢失2质粒结构不稳定性某些质粒结构发生改变，不产生外源蛋白，即结构不稳定性。若保留了抗生素抗性基因，突变株仍能在含有抗生素的培养基中生长。3宿主细胞突变宿主细胞的突变通常改变细胞调节，减少目标蛋白的合成。例如，利用宿主细胞的启动子控制外源蛋白表达。宿主细胞启动子的改变，将大大改变质粒编码蛋白的生产水平。4生长速率占优势的不稳定性质粒稳定性的分析方法影响质粒稳定的因素与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响宿主对质粒稳定的影响质粒拷贝数重组质粒的表达对质粒稳定性的影响使质粒稳定的措施组建合适载体，选择适当宿主施加选择压力–抗生素添加法–抗生素依赖变异法–营养缺陷型法控制基因过量表达控制培养条件（温度、pH、DO）三、表达效率及质粒拷贝数控制工程菌的表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的。用工程菌生产β-内酰胺酶。在25℃下培养至浊度为5。再将培养温度提高至37℃，则质粒拷贝数增加，产物β-内酰胺酶活性增加37倍左右。根据目标基因产物的表达模式而定。适宜的诱导时间：非常重要诱导物的浓度及其发酵温度：影响表达量，产物存在形式。温度诱导、乳糖或乳糖结构类似物诱导、氧饥饿诱导、葡萄糖饥饿诱导、甲醇诱导等。3.1.4.3终点控制1化学诱导表达化学诱导型启动子：lac、tac、T7等诱导时间：对数生长期2温度诱导表达温度诱导型启动子：PL、PR启动子两段培养发酵诱导时间：菌体生长的对数期或稍后一些，升高温度，合成产物。生长与表达的影响因素不同发酵条件下工程菌发酵结果通气量搅拌转速DOpHOD600诱导时间菌体湿重蛋白量111501.87.00.741.913.8%222502.67.80.7742.0816.7%335003.87.50.7462.1018.2%435004.07.00.8362.2726.4%535003.67.02.4465.1858.9%*鲤鱼生长激素基因工程菌a溶氧浓度对工程菌发酵的影响bpH值对工程菌生长和表达的影响在相同通气量和搅拌速度下，pH值对不同菌群生长影响不大，而对外源蛋白表达有一定影响。工程菌培养采用两阶段培养工艺，前期为菌体生长阶段，后期为蛋白诱导表达阶段。偏碱性的pH对外源蛋白的表达不利。表达开始要调节pH在6.8-7.0之间，以保证外源蛋白的高水平表达。生长与表达的影响因素3诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间对酶表达水平和活力的影响诱导时间酶活力酶表达水平00.02152.337%2118.857%3120.867%4165.068%5139.964%*L-天冬酰氨酶生长与表达的影响因素3诱导时间对外源蛋白表达的影响诱导时间：加入诱导剂后的培养时间随着诱导时间的延长，外源蛋白的表达量增加。但外源蛋白在细胞内的积累，对重组菌产生毒性，合成速率下降，甚至产物被分解。生长与表达的影响因素４诱导时机对表达的影响以天冬酰氨酶表达为例，在A600=0.295*10时生长速度比较快，这时菌体进入诱导状态，酶蛋白的积累加快，酶活和表达水平都较高。而菌体进入对数期后期，由于发酵液中营养的消耗，氧气的缺乏及代谢产物的积累，使菌体的生长速度明显受到抑制。生长与表达的影响因素诱导时机对酶表达水平和活力的影响生物量（A600）酶活力酶表达水平0.0156.015.0%0.04919.131.1%0.16072.541.5%0.225102.649.8%0.295165.057.7%0.360105.553.4%0.41062.444.5%0.45030.222.5%*L-天冬酰氨酶生长与表达的影响因素5减少乙酸积累的对策宿主菌可通过诱变使乙酸生成途径中的两个关键酶突变或活性降低，使乙酸合成受阻。培养基使用基本培养基用甘油取代葡萄糖加入某些氨基酸（甘氨酸、甲硫氨酸）调整培养基pH值生长与表达的影响因素降低比生长速率细菌比生长速率高，乙酸的比生成速率就高。较低的比生长速率虽然产酸少，但对产物表达不利。选取合适的比生长速率才能达到高密度、高表达发酵。降低培养温度将温度从37℃降低到26-30℃，可降低菌体对营养物的吸收率，从而减少有机酸的形成。生长与表达的影响因素透析培养可利用透析技术除去发酵液中有害物质，降低乙酸的含量从而实现重组菌的高密度发酵。Lee等用中空纤维膜过滤装置除去乙酸，可在较高的葡萄糖浓度下培养重组菌而得到较高的密度。生长与表达的影响因素限制性流加葡萄糖目前大多数高密度发酵均采取了限制性流加葡萄糖的方法。利用反馈的参数，如pH，μ，OUR，CER作为控制对象，和葡萄糖流加相关联，控制流加量，使培养基中葡萄糖的浓度限定在较低水平。生长与表达的影响因素酿酒酵母作为表达宿主菌的问题：缺乏强有力的严格调控的启动子。目前一些常用的启动子很难精确控制或需要大量昂贵的诱导物，如半乳糖苷酶启动子需要半乳糖的诱导；分泌效率低，特别是对分子量大于30KD的外源蛋白几乎不分泌；表达菌株不够稳定，表达质粒易于丢失；不适于高密度培养。甲醇营养型酵母甲醇营养型酵母的重要特性用作表达宿主菌的主要是Hansenula和Pi