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国家自然科学基金申请书2010版第1页版本1.003.356申请代码H1606受理部门收件日期受理编号解除保护国家自然科学基金申请书(2010版)资助类别：面上项目亚类说明：附注说明：项目名称：Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?申请人：电话：依托单位：通讯地址：邮政编码：266021单位电话：电子邮箱：申报日期：2010年2月26日国家自然科学基金委员会国家自然科学基金申请书2010版第2页版本1.003.356基本信息yoKWT/OQ申请人信息姓名性别男出生年月1973年4月民族汉族学位博士职称副主任医师每年工作时间（月）8电话电子邮箱传真国别或地区中国个人通讯地址工作单位主要研究领域肿瘤分子生物学依托单位信息名称联系人电子邮箱电话网站地址合作研究单位信息单位名称复旦大学[在此录入修改]项目基本信息项目名称Pyk2促进肝癌细胞迁移的一个新的分子机制研究：结合并磷酸化E-cadherin?资助类别面上项目亚类说明附注说明申请代码H1606:肿瘤复发与转移H1617:消化系统肿瘤基地类别研究年限2011年1月—2013年12月研究属性基础研究申请经费35.0000万元摘要(限400字)：E-cadherin的丧失与肝癌转移密切相关。其丧失的主要原因是由于其酪氨酸残基被磷酸化后蛋白被降解。我们通过酵母双杂交发现一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶Pyk2。Pyk2活性增强可促进肝癌细胞迁移。本课题假设Pyk2结合并磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin蛋白降解，细胞迁移性增加。本课题设计首先通过GSTpulldown、免疫共沉淀证明二者相互作用可靠；其次通过磷酸化实验确证Pyk2可以磷酸化E-cadherin；然后应用细胞迁移实验和裸鼠成瘤实验确定：Pyk2通过磷酸化E-cadherin而影响肝癌细胞迁移和肿瘤转移；最后分析在人肝癌标本中二者表达的相关性以及与转移的关系。本课题新发现Pyk2可以直接磷酸化E-cadherin，促进肝癌细胞迁移和肿瘤转移，具有国际先进性。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解，对于药物研发提供新的思路。关键词(用分号分开，最多5个)肝癌；E-cadherin；Pyk2；肿瘤转移国家自然科学基金申请书2010版第3页版本1.003.356经费申请表（金额单位：万元）科目申请经费备注（计算依据与说明）一.研究经费28.75001.科研业务费7.6000（1）测试/计算/分析费2.1000DNA测序，生物信息分析，统计分析（2）能源/动力费（3）会议费/差旅费1.0000参加学术会议3-4人次（4）出版物/文献/信息传播费3.0000文献检索，发表论文，专利申请（5）其他1.5000成果鉴定2.实验材料费21.1500（1）原材料/试剂/药品购置费17.1500各种试剂盒，脂质体，抗体，细胞培养，实验耗材（2）其他4.0000动物饲养，临床调研3.仪器设备费0.0000（1）购置（2）试制4.实验室改装费5.协作费二.国际合作与交流费1.50001.项目组成员出国合作交流2.境外专家来华合作交流1.5000邀请美国康奈尔大学关军林教授合作交流三.劳务费3.0000研究生加班补贴四.管理费1.75005%管理费合计35.0000与本项目相关的其他经费来源国家其他计划资助经费其他经费资助（含部门匹配）其他经费来源合计0.0000国家自然科学基金申请书2010版第4页查看报告正文撰写提纲报告正文一、立项依据与研究内容：（一）项目的立项依据原发性肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，我国的肝癌发病数占全球所有肝癌病例的一半左右，因此我国对于肝癌的研究显得非常迫切[1]。肝癌非常容易转移，其复发转移是治疗失败的主要原因。了解肝癌侵袭转移的相关机制，对于设计合理的治疗药物，进一步提高我国肝癌的治疗水平具有重要意义[2]。E-cadherin在肝癌细胞的侵袭、转移中起到了不可忽视的作用。E-cadherin属于钙粘附蛋白家族(Cadherin家族)，在调节细胞与细胞之间、细胞与基质之间的粘附反应，介导细胞间的接触抑制和凋亡等方面发挥重要作用。E-cadherin与β-catenin、p120等形成复合体发挥上述功能[3]。E-cadherin与多种肿瘤的浸润转移密切相关[4-5]。有人认为提高E-cadherin的表达可以成为肿瘤治疗的一个方向[6]。与其他肿瘤类似，研究表明E-cadherin在肝细胞癌的阳性率显著低于癌旁组织及正常肝组织，表达越低则肿瘤病理分级越差，也越容易出现转移[7-9]。有人报道缺乏E-cadherin表达的人肝癌细胞株非常容易发生转移，但是转染E-cadherin后这种特性发生逆转，说明E-cadherin在肝癌细胞转移过程中发挥着重要的作用[10]。E-cadherin丧失或低表达的机制至今仍然不是完全清楚。目前认为可能是由于基因突变导致功能丧失、启动子甲基化后转录沉默[11]以及E-cadherin蛋白被磷酸化后水解等。但是在亚洲人群中基因突变和启动子甲基化都不常见[12-13]。因此最大的可能性是E-cadherin蛋白被磷酸化后水解。有文献证明，酪氨酸残基磷酸化的E-cadherin能够与Hakai（一种E3泛素连接酶）结合，使其泛素化而降解[14]。那么有多少酪氨酸激酶参与这个机制呢？有报道EGFR，IGF-1R能够磷酸化E-cadherin。对于E-cadherin磷酸化的调节机制目前仍然不是非常明确。为了解E-cadherin在肝癌细胞的分子信号通路，我们以E-cadherin（胞内段）为诱饵应用酵母双杂交（CytoTRAP系统）在肝脏的cDNA文库中筛选到一个新的能与E-cadherin相互作用的非受体型酪氨酸激酶-Pyk2。那么，Pyk2是否能磷酸化E-cadherin并调节细胞迁移呢？Pyk2(prolinerichtyrosinekinase2)是一种富含脯氨酸的非受体型酪氨酸蛋白激酶，与FAK同源度较高，属于FAK家族。Pyk2是酪氨酸激酶家族中的后起之秀，在调节细胞存活、增殖和迁移[16]方面受到越来越多的关注。Pyk2信号通路的活化能够增强细胞运动和迁移，研究发现Pyk2在多种肿瘤的侵袭和转移中起作用[17-18]。其中Sun等研究表明，Pyk2在59%的肝癌组织中表达上调，Pyk2高表达与肝癌组织体积、Edmonson分级国家自然科学基金申请书2010版第5页呈正相关，Pyk2表达越高病人预后越差。动物实验显示在侵袭边缘的肝癌细胞和转移到肺结节中的肝癌细胞均发现Pyk2高表达。肝癌细胞株转染Pyk2后，其迁移功能增强；而用裸鼠做实验发现抑制Pyk2的活性后肝癌肿瘤的大小和肺转移率都较对照明显减少[19-20]。Pyk2调节肿瘤转移的具体机制是什么呢？有研究表明，在肝癌细胞中，Pyk2提高c-Src的磷酸化水平和活性，与c-Src形成复合体激活ERK通路，从而增强肝癌细胞的侵袭性[19-20]；也有报道Pyk2与PECAM-1（血小板/内皮细胞粘附分子，与E-cadherin一样都属于钙粘附蛋白家族）结合并且都影响肿瘤细胞的侵袭性[21]；还有报道RhoC通过激活Pyk2促进前列腺癌转移[18]以及与SOCS3、Cyr61有关等[22-23]。总而言之，目前Pyk2调节肿瘤细胞转移的具体机制仍不十分清楚。Pyk2与E-cadherin能否结合并调节肝癌细胞的侵袭转移呢？这是我们想要研究的问题。我们继续应用酵母双杂交反复验证、GST-Pulldown实验、免疫共沉淀证明二者相互作用是可靠的（具体结果见研究基础）。那么，现在的问题是二者在体内状态下是否结合？结合后的调节机制是什么？二者的结合位点在什么地方？结合后如何调节细胞迁移以及影响肿瘤转移？考虑到Pyk2是一个激酶蛋白，我们的前期工作发现E-cadherin与Pyk2的激酶部分结合，因此有两种可能性。一种是Pyk2磷酸化E-cadherin，另外一种就是E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性。我们认为第一种可能性较大。有文献报道，Pyk2能磷酸化VE-cadherin（E-cadherin同源家族成员）并且抑制其与Catenin，P120等形成复合体[24-25]。E-cadherin与VE-cadherin同源性很高，理化性质相似，Pyk2能够磷酸化VE-cadherin应该也有可能磷酸化E-cadherin。因此我们有理由推测，由于肿瘤始动因素的作用，Pyk2表达增多，活性增强，从而磷酸化E-cadherin，导致E-cadherin降解，最终使细胞迁移性增强。但是也不能排除第二种可能性，E-cadherin抑制Pyk2的磷酸激酶活性，从而导致肿瘤细胞侵袭性下降。申请人以前的工作就发现钙粘附蛋白家族的另外一个成员γ-Protocadherins能够抑制Pyk2的活性[26]，申请人做这方面工作时曾取E-cadherin做对比参照，结果发现抑制Pyk2激酶活性不是很明显（本数据未发表），因此不支持第二种可能性。二者具体如何调节还需要进一步实验来证实。本课题的设计主要是为了解答上述问题。首先在前期工作基础上继续明确Pyk2与E-cadherin能相互作用以及调节机制；其次应用细胞迁移实验确定二者的调节对肿瘤细胞迁移、侵袭性的影响；然后应用裸鼠成瘤转移实验明确二者的调节在对肝癌远处转移的影响；最后分析在肝癌病人组织标本中二者表达的相关性以及与转移的相关性。本课题在国际上最新发现Pyk2与E-cadherin直接相互作用，并且确定其结合机制，明确这种调节与肝癌细胞迁移力和肿瘤转移的关系。这对于肝癌侵袭转移的复杂机制有新的理解。许多新型抗癌药物如赫赛汀、格列卫、吉非替尼、厄洛替尼都是以酪氨酸激酶为治国家自然科学基金申请书2010版第6页疗靶点，取得非常好的疗效。本研究对于确定E-cadherin和酪氨酸激酶Pyk2做为分子治疗靶点、设计合理的治疗药物可以提供更有利的素材。参考文献：[1]HeJ,GuD,WuX,etal.MajorcausesofdeathamongmenandwomeninChina.NEnglJMed2005;353:1124–34.[2]吴孟超，廖美琳，陆嘉德常见恶性肿瘤治疗进展上海科技教育出版社2007[3]BryantDM,StowJL.TheinsandoutsofE-cadherintrafficking.TrendsCellBiol.2004Aug;14(8):427-34[4]WellsA,YatesC,ShepardCR.E-cadherinasanindicatorofmesenchymaltoepithelialrevertingtransitionsduringthemetastaticseedingofdisseminatedcarcinomas.ClinExpMetastasis.2008;25(6):621-8.Epub2008Jul4[5]SalonC,LantuejoulS,EyminB,etal.TheE-cadherin-beta-catenincomplexanditsimplicationinlungcancerprogressionandprognosis.FutureOncol.2005Oct;1(5):649-60[6]HowardEW,CammKD,WongYC,etal.E-cadherinupregulationasatherapeuticgoalincancertreatment.MiniRevMedChem.2008May;8(5):496-518.[7]GuoC,LiuQG,YangW,etal.Relationamongp130Cas,E-cadherinandbeta-cateninexpression,clinicopathologicsignificanceandprognosisinhumanhepatocellularcarcin