05-药物分析yzg

L/O/G/O药物分析PharmaceuticalAnalysisL/O/G/O第五章体内药物分析2019/8/163第五章体内药物分析常用体内样品的制备与贮藏1体内样品分析的前处理2体内样品分析方法与方法验证32019/8/164第五章熟悉:体内样品的采集与制备方法体内样品分析方法验证的技术要求了解:体内药物分析的性质与意义掌握:体内药物分析的特点和应用体内样品分析的前处理体内样品分析方法验证的内容2019/8/165体内药物分析学习要求体内药物分析的特点和应用体内样品分析的前处理体内样品分析方法验证内容体内药物分析的性质与意义体内样品的采集与制备方法体内样品分析方法验证的技术要求掌握了解熟悉2019/8/166概述体内药物分析方法建立与验证净化与浓集原形,代谢物体液或组织•色谱;免疫分析;生物•全面验证和部分验证•原形药物或其代谢物•缀合物,蛋白结合物体内样品存在形式样品制备分析方法•去蛋白;萃取;膜分离•水解;化学衍生化•血液是主要样品•尿液,唾液,头发和脏器2019/8/167概述1.体内样品的特点(1)采样量少:ml~µl级;且不易重新获得(2)待测物浓度低:µg/ml~ng/ml级,甚至pg/ml(3)干扰物质多:尤其是血样和组织中的蛋白质2.体内药物分析的特点(1)样品需经纯化浓集,或化学衍生化处理(2)对分析方法的灵敏度及专属性要求较高(3)分析工作量大,数据处理和结果阐明繁杂体内药物分析的特点主要来自于体内样品的特点特点2019/8/168第一节常用体内样品的制备与贮藏体内样品的种类1体内样品的采集与制备2体内样品的贮藏与处理32019/8/169体液组织排泄物一、体内样品的种类血液;唾液脑脊液;胃液;胆汁;乳汁;精液;泪液尿液粪便;汗液胃;肠;肝;肾;肺,脑;肌肉;头发2019/8/1610常见体内样品1.血样的采集静脉,1-5ml≤1/102.血浆的制备抗凝剂,1000g离心5-10min淡黄色上清液3.血清的制备30min-1h1000g离心5-10min上层淡黄色液体4.全血的制备抗凝剂,不离心1.尿样的特点原形,代谢物及缀合物药物浓度较高收集量大(1~5L)2.尿样的采集自然排尿规定时间段(6-8h)(时间尿)3.尿样的贮藏加入适当防腐剂TDM测定S代替P进行临床监测1.唾液的组成腮腺,舌下腺和颌下腺2.唾液的采集漱口15min,安静状态,自然流出的唾液物理或化学方法刺激3.样品的制备3000r/min离心10min,上清液1.样品的制备制成水性基质匀浆溶液2.样品的处理(1)沉淀蛋白法(2)酸/碱水解法(3)酶水解法蛋白水解酶中的枯草菌溶素血样尿样唾液组织二、体内样品的采集与制备50-60％20-40％2019/8/1611三、体内样品的贮存与处理(一)冷藏与冷冻短期保存:冰箱(4℃)冷藏长期保存:冷柜(-20℃/-70~-80℃)冷冻,小体积分装1.血浆/血清:分离(≯2h),硬质玻璃/聚乙烯管(EP),冷冻2.尿样:冷藏(24~36h)加防腐剂3.唾液:冷冻保存时,解冻后充分搅匀后再用(二)去活性采样后立即终止酶的活性常用方法:液氮速冻,微波照射,匀浆/沉淀,加酶活性阻断剂(氟化钠)或抗氧剂(VC),煮沸2019/8/1612第二节体内样品分析的前处理体内样品预处理的目的1常用体内样品预处理方法2前处理(分离,浓集,改性)为药物的测定提供条件前处理是体内药物分析过程中重要且繁复的工作2019/8/1613仪器污染,劣化(去蛋白)提高测定灵敏度/选择性化学改性(衍生化)血浆蛋白结合物;缀合物使待测药物/代谢物释放测定药物/代谢物总浓度1.使待测组分游离2.满足测定方法的要求3.改善分析环境一、体内样品前处理的目的样品介质组成复杂:分离待测组分浓度低:浓集前处理2019/8/1614二、体内样品前处理的方法去除蛋白质法分离与浓集法缀合物水解法(一)(二)(三)化学衍生化法(四)2019/8/1615(一)去除蛋白质法加入与水混溶的有机溶剂,蛋白析出→药物释放乙腈,甲醇,丙酮,四氢呋喃等血浆/血清与有机溶剂的体积比1∶(2-3)饱和硫酸铵,硫酸钠,硫酸镁,氯化钠等血清与饱和硫酸铵溶液的比1∶210%三氯醋酸或6%高氯酸溶液血清与强酸的比1∶0.6上清液呈强酸性(pH≤4)酸性分解的药物不宜用热变性蛋白质沉淀通常90℃方法简单只能除去热变性蛋白待测物热稳定性好1.溶剂沉淀法2.中性盐析法3.强酸沉淀法4.热凝固法2019/8/1616(二)分离与浓集法液相萃取法固相萃取法超滤法1.2.3.2019/8/16171.液相萃取法溶剂的选择原则溶剂的用量水相的pH(1)(2)(3)提取操作(4)2019/8/1618(1)溶剂的选取原则①对药物分子未电离形式可溶,对电离形式不溶；②沸点低,易挥发;③与水不相混溶;④无毒,不易燃烧;⑤具有化学稳定和惰性;⑥不影响紫外检测溶剂紫外截止波长(nm)沸点(℃)↓极性增加↓正己烷21069环己烷21081甲苯285111异丙醚*22068乙醚*22035醋酸戊酯285149三氯甲烷24561甲基异丁基酮230116醋酸乙酯26077正丁醇215118*:含过氧化物；:肝脏毒性,有致癌作用①辅助试剂的使用乙醚(1.2%水):氯化钠②混合溶剂的使用正己烷-异丙醇(95:5)2019/8/1619(2)溶剂的用量有机相与水相(样品)体积比为1:1~5:1碱性药物pH高于pKa1~2单位酸性药物pH低于pKa1~2单位碱性下提取,可减少内源性物质(酸性)的干扰碱性下不稳定,在中性用三氯甲烷和异丙醇提取(3)水相的pH提取1次若提取回收率较低(低于50%),提取2~3次脂溶性干扰物,可进行小体积水溶液反提取(4)提取操作2019/8/16202.固相萃取法固相萃取法的原理固相萃取法操作步骤注意事项(1)(2)(3)固相萃取法的特点(4)自动化固相萃取(5)2019/8/1621(1)固相萃取法的原理含药物体内样品通过小柱时,受到“吸附”,“分配”,“离子交换”或其它亲和力作用,药物及内源性物质同时被保留在固定相(填料)洗脱方式有两种:①冲洗溶剂洗去干扰物,再用对药物亲和力更强的溶剂洗脱药物;②药物直接被洗脱,干扰物保留2019/8/1622(2)固相萃取法操作步骤第1步:甲醇润湿小柱,活化填料;净化填料第2步:水/缓冲液冲洗小柱,去除甲醇;甲醇含量过低(低于5%)致C18链弯曲折叠,回收率降低第3步:加样,使样品通过小柱,并弃去滤过液第4步:水/缓冲液冲洗小柱,去除内源性及其它干扰物质第5步:洗脱溶剂洗脱待测物,收集洗脱液,平衡2019/8/1623(3)注意事项①样品(血浆)通过萃取柱的流速在1-2ml/min;②冲洗液和洗脱剂的强度与用量适当,否则导致药物损失/选择性下降,通常选用可与水混溶的洗脱剂;③萃取碱性药物时,洗脱剂中常加酸,有机胺,氨水,醋酸铵或离子对试剂2019/8/1624(4)固相萃取法的特点2019/8/1625(5)自动化固相萃取法对于单个样品处理,SPE操作省时对于大量样品的处理半自动SPE:萃取过程机械化全自动化仪器:通过柱切换技术实现固相萃取与HPLC联用2019/8/1626柱切换:固相萃取-LC/MS/MS(5)自动化固相萃取法2019/8/16273.超滤法ultrafiltration是一种膜分离技术按照截留分子量,选择半透膜,可分离30~1000kD的可溶性生物大分子无化学试剂,无相变化提取操作(4)简便,游离药物分析的首选方法;尤其适合TDM2019/8/1628(三)缀合物水解法简便,快速水解过程中发生药物分解专一性较差葡萄糖醛酸苷酶或/和硫酸酯酶专属性强时间较长可引入粘蛋白溶剂萃取过程中缀合物(尤其硫酸酯)直接分解测定尿药总量,水解缀合物趋向于直接测定缀合物1.酸水解法2.酶水解法3.溶剂解法2019/8/1629(四)化学衍生化法1.在GC中的应用(1)硅烷化:三甲基硅烷(TMCS)(2)酰化:三氟乙酸酐(TFAA)(3)烷基化:碘庚烷(C7H15I)(4)不对称衍生化:(S)-N-三氟乙酰脯氨酰氯(ST-FPC)2.在HPLC中的应用(1)衍生化的分类柱前/柱后;在线/离线(2)衍生化方法(1)紫外衍生化(2)荧光衍生化(3)非对映体衍生化GC:①提高药物的挥发性;②增加药物的稳定性;③生成非对映异构体HPLC:①提高检测灵敏度;②改善色谱分离容量分析法2019/8/1630第三节体内样品分析方法与方法验证分析方法的建立一、分析方法的验证二、2019/8/1631一、分析方法的建立分析方法的选择分析方法建立的一般程序(一)(二)2019/8/1632(一)分析方法的选择HPLC,GCHPLC-MSn,GC-MSRIA,EIA,FIA;适用于大分子TDM应用较多抗生素生物利用度,等效性,TDM应用较少常用的检测方法:色谱分析法,免疫分析法和生物学方法2019/8/1633(二)分析方法建立的一般程序待测物,内标(必要时)的标准物质色谱柱(填料),流动相,溶剂,进样量试剂/溶剂试验;生物介质试验质控样品试验代谢产物对待测物,内标物的干扰配伍用药的干扰分析方法的建立和验证过程系同步进行为便于讨论,以色谱分析法为例分别叙述1.色谱条件的筛选2.色谱条件的优化3.实际样品的测试2019/8/1634二、分析方法的验证特异性标准曲线与定量范围定量下限(一)(二)(三)精密度与准确度(四)样品稳定性(五)提取回收率(六)方法样品2019/8/1635二、分析方法的验证分析过程的质量控制未知样品浓度超限的处理药用内源性物质的测定(七)(八)(九)微生物/免疫学方法的验证(十)名词解释(十一)分析其他2019/8/1636(一)特异性比较标准物质与6个不同个体的空白生物介质和QC样品软电离质谱(LC-MS)介质效应比较QC样品和至少6个不同个体用药后的实际样品必要时LC-DAD/MS确证峰的单一/同一比较待测药物,同服药物,待测药物的QC样品和添加有同服药物的干扰样品特异性(specificity),又称专属性或专一性,通常与选择性(selectivity)互用1.内源性物质2.未知代谢物3.伍用药物4.参比方法参比方法横坐标(x),拟定方法纵坐标(y),最小二乘y=a+bxa恒定干扰b比例干扰(如,标记抗原不纯,交叉免疫)2019/8/1637(二)标准曲线与定量范围1.标准曲线的建立(二)少数方法(如,IA)外,通常为线性模式线性回归:最小二乘法或加权最小二乘法自变量(x)为药物浓度,因变量(y)为响应信号强度(1)系列标准溶液:n≥6(不包括0点);等比系列(2~3);通常为100~1000倍(2)内标溶液:浓度相当于系列标准溶液的几何平均浓度(3)系列标准样品:空白生物介质,加入系列标准溶液(4)标准曲线的绘制:药物浓度,以单位体积(如血浆)或质量(如肝脏)的生物介质中加入标准物质的量表示2019/8/1638(二)标准曲线与定量范围2.限度要求通常用至少6个浓度建立标准曲线非线性相关(如IA)可能需要更多浓度点定量范围覆盖全部待测样品浓度范围定量上限(ULOQ)高于用药后的峰浓度(Cmax)定量下限(LLOQ)低于Cmax的10%~5%(1/10~1/20)标准曲线各浓度点的回归计算值(x’)与标示值(x)之间的偏差〔bias=[(x’-x)/x]×100%〕在可接受的范围之内最低浓度点的偏差在±20%以内其余浓度点的偏差在±15%以内2019/8/1639(三)定量下限1.测定法取同一生物介质,制备至少5个独立的标准样品,其浓度应使信噪比(S/N)大于5,依法进行精密度与准确度验证定量下限(LLOQ):标准曲线上的最低浓度点符合准确度和精密度要求2.限度要求准确度应在标示浓度的80%~120%范围内,相对标准差(RS