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2.2细胞破碎2.2.1、不同类型细胞壁的结构2.2.2、细胞破碎原理2.2.3、细胞破碎方法2.2.4、检测细胞破碎效果的方法2.2.5、如何选择细胞破碎方法细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释放到液相中。动物细胞结构2.2.1、不同类型细胞壁的结构植物细胞结构原核细胞的结构真菌细胞(酵母)的结构细胞破碎的阻力细菌破碎的主要阻力来自于肽聚糖的网状结构。网状结构越致密，破碎的难度越大。酵母细胞壁破碎的阻力也主要决定于壁结构交联的紧密程度和它的厚度。成熟的植物细胞壁分为初生壁和次生壁。不同细胞破碎的难易程度植物细胞真菌（如酵母菌）革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌动物细胞2.2.2、细胞破碎的机理A、压撞B、剪切C1、渗透C2、溶胀D、破壁破膜2.2.3、细胞破碎方法破碎方式机械法非机械法液体剪切作用固体剪切作用干燥处理溶胞作用珠磨法压榨高压匀浆超声破碎酶溶法化学法物理法一.机械破碎方法（1）高压匀浆法影响细胞破碎的因素：温度压力循环操作次数细胞浓度阀座形式温度：破碎率随温度的增加而增加例如：操作温度由5℃增加到30℃，破碎率约提高1.5倍。高温对破碎有利，但应考虑热变性压力每增加10MPa，温度2℃。适用于酵母和细菌细胞的破碎。（2）超声破碎法作用机理：在超声波作用下，液体发生空化作用(cavitaton)，空穴的形成、增大和闭合产生极大的冲击波和剪切力，使细胞破碎。超声波的细胞破碎效率与细胞种类、浓度和超声波的声频、声能有关。超声波的负面影响：1、温度上升：悬浮液预冷，夹套冷却短期冷却与短期破碎交替。2、超声处理会引起诸如自由基这样的化学效应，破坏目的产物，可加入游离基清除剂（组氨酸，谷胱甘肽等）予以消除。3.影响因素：声强、声频、温度、时间、离子强度、pH、细胞类型。(3).研磨法：将剪碎的动物组织置研钵中，用研磨棒研磨。为提高研磨效率，也可加入一定量的石英砂（注意“吸附”）。大规模生产时，可用电动研磨法（如球磨机）此法为温和破碎，适用于动物细胞和细菌细胞的破碎。（4）组织捣碎器法(组织匀浆)：捣碎器(8000~10000r/min）处理30~45S,植物和动物细胞可完全破碎，但对微生物需加石英砂才有效；注意必须低温捣碎，以防温度升高引起有效成分变性，因此时间不宜过长——剧烈方法优点：1.内含物全部释放2.时间短，效率高，成本低3.通用性强，适于实验室和工业生产缺点：1.需要高的能量2.产生高温，高剪切力，引起产品变性失活3.非专一性，给分离造成困难机械法破碎细胞的优缺点二.化学和生物化学渗透法(非机械法)（1）化学渗透法化学渗透法是使用某些有机溶剂(如苯、甲苯)、螯合剂(EDTA)、表面活性剂(SDS、tritonX-100)、变性剂(盐酸胍、脲)等改变细胞壁或膜的通透性，从而使内含物有选择地渗透出来。化学渗透取决于化学试剂的类型以及细胞壁和膜的结构与组成，不同试剂对各种微生物细胞作用的部位和方式有所差异。优点：1.产物释放有一定的选择性2.不需要特殊设备3.细胞外形保持完整，细胞碎片少，浆液粘度低，利于后续分离缺点：1.通用性差2.时间长，效率低3.某些化学试剂有毒应用：检测胞内酶活性释放胞内物质研究（2）酶溶法作用机理：酶溶法(Enzymaticlysis)利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞，使细胞壁受到部分或完全坏后，再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜，进一步增大胞内产物的通透性。常用的溶酶：溶菌酶、β-1，3-葡聚糖酶、β-l，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽链内切酶、壳多糖酶等。优点：产品释放选择性高抽提速率和收率高产品破坏少pH、温度外界条件要求低不残留细胞碎片缺点：费用高通用性差存在产品抑制不适于工业生产三.物理渗透法（1）渗透压冲击法：将细胞置于高渗透压的介质中，使之脱水收缩，达到平衡后，将介质突然稀释或将细胞转置于低渗透压的水或缓冲液中，在渗透压的作用下，外界的水向细胞内渗透，使细胞变得肿胀，膨胀到一定程度，细胞破裂，它的内含物随即释放到溶液中。渗透压冲击(Osmoticshock)是在各种细胞破碎法中最为温和的一种，适用于易于破碎的细咆，如动物细胞和革兰氏阴性菌。（2）冻融法：将细胞急剧冻结后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。冻结的作用是破坏细胞膜的疏水键结构，增加其亲水性和通透性。另一方面，出于胞内水结晶使胞内外产生溶液浓度差，在渗透压作用下引起细胞膨胀而破裂。操作：将细胞急剧冻结至-20～-15℃，使之凝固，然后在室温缓慢融化，此冻结融化操作反复进行多次，使细胞受到破坏。缺点：反复冻融使蛋白质变性，影响活性蛋白质的回收率。冻融法适用于比较脆弱的菌体。（3）干燥法：将细胞用不同的方法干燥（真空、冷冻、喷雾和气流等），细胞膜结合水丧失，渗透性发生变化而破裂。缺点：条件变化剧烈，易引起生物物质变性破碎方法小结分类作用机理适应性机械法珠磨法固体剪切作用可达较高破碎率，可较大规模操作，大分子目的产物易失活，浆液分离困难高压匀浆法液体剪切作用可达较高破碎率，可大规模操作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌超声破碎法液体剪切作用对酵母菌效果较差，破碎过程升温剧烈，不适合大规模操作非机械法酶溶法酶分解作用具有高度专一性，条件温和，浆液易分离，溶酶价格高，通用性差化学渗透法改变细胞膜的渗透性具一定选择性，浆液易分离，但释放率较低，通用性差渗透压法渗透压剧烈改变破碎率较低，常与其他方法结合使用冻结融化法反复冻结-融化破碎率较低，不适合对冷冻敏感目的产物干燥法改变细胞膜渗透性条件变化剧烈，易引起大分子物质失活机械破碎法和非机械破碎法的比较比较项目机械法非机械法比较项目机械法非机械法破碎机理切碎细胞溶解局部壁膜效率效率高效率低碎片大小碎片细小碎片较大设备需专用设备不需专用设备内含物释放全部部分通用性强差粘度高（核酸多）低（核酸少）经济成本低成本高时间时间短时间长应用范围实验室、工业范围实验室范围