07药物遗传毒性和致癌性研究现状和动向

药物遗传毒性和致癌性研究现状和动向2019/8/171常艳国家上海新药安全评价研究中心、EPA可供参考的遗传毒性指导原则遗传毒性试验的指导原则体外：2项试验•细菌回复突变试验（Ames）——Required•染色体畸变试验（CA）OR•小鼠淋巴瘤细胞tk基因突变试验（MLA）体内：1项试验•微核试验（MN）——Required《药物遗传毒性研究技术指导原则》ZHGPT2-1,2007等同于ICHS2B:IV.C.1Short-TermTestsforGeneticToxicityJuly2007Redbook2000:IV.C.1.aBacterialReverseMutationTestRedbook2000:IV.C.1.bInvitroMammalianChromosomalAberrationTestRedbook2000:IV.C.1.cMouseLymphomaThymidineKinaseGeneMutationAssayRedbook2000:IV.C.1.dMammalianErythrocyteMicronucleusTest~2011•2006.06ICHSC同意启动修订工作•2006.10ICHEWG讨论筹划修订方法•2007.05对修订内容达成一致意见，开始起草S2(R1)•2007.10完成起草的S2(R1)•2008.02签署S2(R1)，完成step2•2008.06审议意见，回答公共注释•2008.11未按期开会（未获得彗星试验数据）•2009.06体内试验单次和重复给药方案都接受FDA对取消体外细胞试验或降低最高浓度和细胞毒性提出异议•2011.11S2(R1)正式颁布遗传毒性标准组合试验的修订2009~2011=S2(R1)S2R1的修订宗旨：减少体外哺乳动物细胞试验的假阳性动物试验3R原则（替代、减少和优化）Invivo：建议整合入重复给药毒性实验中每次实验不必使用平行的阳性对照应用流式细胞仪检测=S2(R1)选择一选择二细菌回复突变试验（withrepeat）细菌回复突变试验（Norepeat）细菌回复突变试验（Norepeat）体外哺乳动物细胞试验：CA/MLA10mMCellgrowth:50%/RTG:80%体外哺乳动物细胞试验：CA/MLA/MN1mM≤50%/≥80%无体外哺乳动物细胞试验体内微核试验（单独一项且是急性毒性试验）体内微核试验（整合至一般毒理试验中）一项体内微核试验+一项体内不同检测终点/组织试验（肝Comet试验）（整合至一般毒理试验中或联合在同一个试验）(R1)修订小结S2A和S2B整合入一个指导原则中；提供可选择的遗传毒性试验组合；减少体外哺乳动物细胞试验不相关的阳性；体内遗传毒性试验可以整合入重复给药毒性试验中；无需每一项体内试验都设同步的阳性对照；体外细菌突变试验无需重复试验。(R1)PfuhlerS.etal.2009细菌回复突变试验（Ames试验）人工诱变的突变株在组/色氨酸操纵子中有一个突变，突变的菌株必须依赖外源性组/色氨酸才能生长，而在无组/色氨酸的选择性培养基上不能存活，致突变物可使其基因发生回复突变，使它在缺乏组/色氨酸的培养基上也能生长。野生型（原养型）突变型（缺陷型）试验测试系统：细菌鼠伤寒沙门氏菌：组氨酸营养缺陷型埃希氏大肠杆菌：色氨酸营养缺陷型菌株特性鉴定菌株组/色氨酸突变缺失可检测的突变类型修复LPSVIT质粒TA1535G46urvB-rfa-bio----碱基置换TA1537C3076urvB-rfa-bio----移码TA97D6610urvB-rfa-bio-pKM101移码TA98D3052urvB-rfa-bio-pKM101移码TA100G46urvB-rfa-bio-pKM101碱基置换TA102G428urvB+rfa-bio-pKM101碱基置换WP2uvrAtrypEuvrA---pKM101碱基置换Ames试验浓度设置阴性对照组/溶剂对照组；受试物至少五个剂量组；阳性对照组；Ames试验方法平板掺入法：-0.1mL受试菌液；-0.1mL受试物、溶剂对照或阳性物溶液；-0.5mL磷酸钠缓冲液/S9混合液；-2.0mL融溶的顶层琼脂（0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－组胺酸）混合后，铺于底层琼脂上，室温凝固。Ames试验预培养法-将下列物质在冰浴上混合：0.5mLS9混合液或0.5mL磷酸缓冲液0.1mL过夜培养菌液（大约10^8菌量）0.01mL受试物溶液（或对照，溶剂和阳性对照物溶液）-将该混合液在37℃下培养20分钟（水浴中）-然后加入2mL含有0.6％琼脂、0.5％NaCl、0.5mM生物素和0.05mML－组胺酸的融溶顶层培养基，铺至基础培养琼脂表面（V-B培养基E），在室温下凝固。Ames试验代谢活化系统大鼠肝S9混合液S9制备方法：取5只雄性大鼠，处死大鼠的前5天单次腹腔注射给予500mg/kg的Aroclor1254。处死，放血，无菌取肝组织，匀浆，经9000g离心10分钟后的上清液部分为S9。将S9分装成2-4mL/管，冷冻保存在-70℃～-85℃。Ames试验结果观察和判定计数突变菌落数－致突变性观察背景菌斑－毒性判断是否具有致突变性Ames试验皿处理组划线全部生长:克隆为组氨酸回复突变克隆无生长：克隆不是组氨酸回复突变克隆Ames试验—案例1测试系统哺乳动物细胞：CHL,CHO人外周血淋巴细胞细胞核型遗传毒性试验的技术要点32染色体畸变试验(CA)剂量设置阴性对照组/溶剂对照组；受试物至少三个剂量组；阳性对照组；染色体畸变试验方法细胞复苏、培养；受试物处理；加入秋水仙素，使细胞停止于分裂中期；收获细胞，滴片空气干燥，染色染色体畸变试验包括代谢活化和非代谢活化条件在处理后6和24小时收获细胞代谢活化条件下，受试物处理时间为3小时染色体畸变试验处理条件读片分析有丝分裂指数－毒性染色体结构畸变染色体数目畸变染色体畸变试验试验系统小鼠淋巴瘤L5178YTK+/-细胞既能够检测点突变，也能够检测出大的染色体损伤自发突变率高，需要定期清除自发突变。33小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）遗传毒性传统试验方法(TK):233aminoacidsCodedbytheautosomaltkgenetkgene:Situatedatthedistalendoftheq-armofchromosome11(mouse)orchromosome17(human)Sizeoftkgene:11kbwith5intronstklocusmutation:tk+tk-allelecausedbyTGtransversionatposition489小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）基本原理：MouselymphomaL5178Ytk+/-3.7.2Ccellline(D.Clive&P.Voytek.MutatRes,1977)L5178Y-3cellline（tk+/+）EMStreatmentL5178Y-3.7.2cellline（tk+/-）L5178Y-3.7cellline（tk-/-）Spontaneousreversemutation(selectedbyTHMGmedium)MLA基本原理(TFTsensitive&THMGresistant)TK-/-cells(TFTresistant&THMGsensitive)MutagentreatmentTK+/-cells(L5178Y,TK6,WTK1)treatedbychemicals,andthenselectedbyTFT(trifluorothymidine)Thegrowingcolony—TFTresistant(TK-/-)mutantMLA基本原理马血清的RPMI1640培养基含20%马血清的RPMI1640培养基小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）基因突变试验中，要使用短时处理(3～4小时)方式。但张立实和Honma等的研究表明，使用长时间(24或48小时)处理可显著提高MLA对某些染色体断裂剂和纺锤体毒物的检出率。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）溴脱氧尿苷（BUdR）作为突变选择剂，后来改用三氟胸苷（TFT）。二者均为胸苷类似物，都能被胸苷激酶磷酸化，其磷酸化产物掺入DNA可导致tk+/-细胞死亡。但TFT的作用比BUdR更迅速，TFT在一个细胞世代即可阻滞tk+/-细胞，因此TFT选择平板背景清晰；而BUdR则需要经历数个细胞世代才能完全阻滞tk+/-细胞，故可产生分散的微小集落（microcolony），形成特征性的背景阴影（backgroundhaze）。因此，现TFT已基本取代了BUdR，成为TK基因突变试验的常规选择剂。小鼠淋巴瘤细胞试验（MLA）基本方法软琼脂平皿法（softagarmethod）在美国使用较多。在平皿中生长的抗性突变细胞集落呈近似正态分布，根据实验结果可计算克隆效率（cloningefficiency，CE）和突变率（mutationfrequency，MF）等指标。微孔平板（microwellmethod）（即96孔培养板）法在欧洲使用较多。在微孔中生长的