08酶工程制药

08酶工程制药S1酶工程制药概述S2固定化酶与固定化细胞S3酶的化学修饰S4酶工程研究的进展S1酶工程制药概述酶工程的概念酶工程（enzymeengineering）是酶学和工程学相互渗透发展而成的一门新的技术科学，它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异性催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。S1酶工程制药概述酶工程的研究内容（1）酶的分离、提纯、大批量生产及应用开发（2）酶和细胞的固定化及酶传感器的研究（3）基因工程酶、遗传修饰酶（突变酶）（4）酶的分子改造与化学修饰、酶的结构与功能关系（5）有机相中的酶反应的研究（6）酶的抑制剂、激活剂的开发及应用（7）抗体酶、核酶、脱氧核酶的研究（8）模拟酶、合成酶、酶分子的人工设计、合成S1酶工程制药概述酶在医药领域的应用在疾病诊断方面的应用（1）根据体内原由酶活力的变化来诊断某些疾病（如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎）（2）用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病（如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量来诊断糖尿病）在疾病治疗方面的应用——药用酶的生产在药物生产方面的应用——酶法制药在分析检测方面的应用S1酶工程制药概述酶法制药：是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。主要技术包括:酶的催化反应酶的固定化酶的非水相催化酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述青霉素酰化酶：制造半合成青霉素和头孢霉素11--羟化酶：制造氢化可的松L-酪氨酸转氨酶：制造多巴-酪氨酸酶：制造多巴核糖核酸酶：生产核苷酸类物质蛋白酶和羧肽酶：将猪胰岛素转化为人胰岛素酶法制药：是指利用酶的催化作用而制造出具有药用功效的物质的技术过程。酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述将猪胰岛素转化为人胰岛素酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述药用酶的生产：是指生产可用于预防和治疗疾病的酶。主要技术包括:药用酶的发酵生产药用酶的分离纯化药用酶的分子修饰酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产S1酶工程制药概述酶法制药药用酶的生产至2004年2月美国FDA批准的生物技术药物产品商品名公司首次批准时间适应证Reteplase，t-PA突变体Retavase(大肠杆菌)Centocor1996.10急性心梗Rasburicase，尿酸降解酶Elitek(酵母)Sanofi-Synthelabo2002.7血浆尿酸症alteplase,tPAActivase(CHO)Genentech1987.11急性心梗，脑中风，肺栓塞urokinase，尿激酶Abbokinase(胎肾细胞)Abbott2002.10肺栓塞Laronidase，粘多糖--L-艾杜糖醛酸水解酶Aldurazyme(CHO)Genzyme2003.4粘多糖贮积病Imiglucerase，葡糖脑苷脂酶Cerezyme(CHO)Genzyme1994.5Gaucher's病Algasidasebeta，半乳糖苷酶-Fabrazyme(CHO)Genzyme2003.4Fabry's病dornasealfa，DNA酶Pulmozyme(CHO)Genentech1993.12囊性纤维化Tenecteplase，t-PA突变体TNKase(CHO)Genentech2000.6急性心梗S2固定化酶与固定化细胞从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞从游离酶到固定化酶均相酶反应系统的缺点：1、水溶液中的游离酶只能一次性使用：既造成酶的浪费，又会增加产品分离的难度和费用，影响产品的质量2、游离酶很不稳定，容易变性、失活从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞从游离酶到固定化酶固定化酶的概念：通过载体将酶限制或固定于特定的空间位置，使之既不易随水流失，又能发挥酶的催化作用，这样的酶制剂就称之为固定化酶（immobilizedenzyme），制备固定化酶的过程称为酶的固定化。固定化酶的最大特点：既具有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性。从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞从游离酶到固定化酶1、可以多次使用，且酶的稳定性提高固定化的葡萄糖异构酶：60-65℃，1000h固定化黄色短杆菌的延胡索酸酶：反应1年活力不变2、酶与底物和产物易于分开：产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高固定化酶的优点从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞3、反应条件易于控制：可实现转化反应的连续化和自动控制4、利用效率高：单位酶催化的底物量增加，用酶量减少5、比水溶性酶更适合于多酶反应从游离酶到固定化酶固定化酶的优点从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞连续的多酶反应主要缺点:固定化时，酶活力有损失从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞固定化的方法物理法结晶法化学法共价结合法分散法交联法物理吸附法包埋法网格型离子结合法微囊型从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞化学法：共价结合法酶与载体以共价键结合——使用和报道最多的方法！载体无机物（玻璃、陶瓷）天然有机物（多糖、蛋白质）合成聚合物（聚酯、聚胺、尼龙）从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞化学法：共价结合法载体-反应基团活性基团（-SH）相关基团活化（-OH、-COOH、-NH2等）双功能试剂（戊二醛）酶-反应基团-/ε-氨基，-/-/-羧基羟基、巯基、咪唑基、酚基等优点：结合牢固，酶不易脱落缺点：反应剧烈，酶活回收低（30%）从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞化学法：共价结合法化学法：交联法双功能/多功能试剂，酶-酶以共价键结合（不需要载体！）酶-反应基团氨基（N末端）、ε-氨基、巯基、酚基、咪唑基交联剂：戊二醛从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞化学法：交联法包埋法：网格型凝胶，细微网格包埋材料：合成高分子（聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂）天然高分子（淀粉、明胶、胶原、海藻胶等）从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞包埋法：微囊型半透膜，颗粒颗粒直径通常为几微米到几百微米，比网格型要小得多，有利于底物与产物的扩散从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞包埋法网格型、微囊型优点：1、酶活回收高——不需要酶蛋白的氨基酸残基参与反应2、适合于小分子底物和产物缺点：酶也易失活——包埋时发生化学聚合反应但可设计反应条件改善从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞固定化酶的方法比较从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞固定化酶的性质固定化也是一种化学修饰，酶本身的结构必然受到扰动酶固定化后，扩散限制效应、空间障碍、载体性质造成的分配效应等因素必然对酶的性质产生影响从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞固定化酶的性质1、酶活力变化：多数情况下，酶活降低Km增大——与底物的亲和力下降2、酶稳定性变化热稳定性提高——最适温度酸碱稳定性提高——最适pH对有机溶剂、酶抑制剂稳定性提高贮藏稳定性提高从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞固定化酶的性质固定化细胞固定化细胞：受物理、化学等因素，被限制自由移动的细胞，保留催化活性，并可反复或连续使用。——在固定化酶的基础在发展而来——基因工程菌从游离酶到固定化酶固定化的方法固定化酶的性质固定化细胞S3酶的化学修饰从天然酶到修饰酶酶的化学修饰的方法化学修饰酶的药用价值化学修饰酶的局限性从天然酶到修饰酶工业用酶稳定性问题对热、酸碱、重金属、抑制剂、有机溶剂等——使用寿命短，工艺成本高药用酶：体内半衰期（最适pH等因素）抗原性改造天然酶的策略1、遗传修饰突变酶——蛋白质工程技术2、化学修饰化学修饰酶——化学修饰试剂主要依据：1、氨基酸残基侧链及修饰剂的反应性2、结构与功能的关系化学修饰的种类1、酶的表面修饰2、酶的分子内部修饰3、与辅助因子相关的修饰1）大分子修饰2）小分子修饰3）交联修饰4）固定化修饰大分子修饰大分子修饰：一些可溶性大分子可通过共价键连接到酶分子表面，形成覆盖层，对于提高药用酶的稳定性、延长体内半衰期、降低或消除抗原性具有重要意义。对修饰剂的要求：1、具有较大分子量2、良好的生物相容性和水溶性3、无毒性4、无免疫原性常用大分子修饰剂1、高分子聚合物聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、聚乙烯醇（PVA）、聚丙烯（PAA）、聚赖氨酸2、天然生物大分子肝素、人血清白蛋白3、糖类及衍生物右旋糖苷及右旋糖苷硫酸酯、糖肽、聚乳糖常用大分子修饰剂产品商品名公司首次批准时间适应证humansomatropin人生长激素ProtropinSOMAVERT(PEG化)GenentechNektar/Pfizer1985.102003.3矮小症肢端肥大症rhG-CSF粒细胞集落刺激因子NeupogenNeulasta(PEG化)AmgenAmgen1991.22002.1白细胞减少interferon-2a干扰素-2aRoferon-APegasys(PEG化)RocheRoche/Nektar1986.62002.10乙肝、丙肝、白血病Kaposi's肉瘤等Interferon-2b干扰素-2bIntronAPEG-Intron(PEG化)Schering-PloughSchering-Plough1986.62001.8乙、丙肝、白血病、Kaposi's肉瘤等聚乙二醇（PEG）具有良好的水溶性和生物相容性，FDA认证：体内无毒性、无残留、无免疫原性至2004年2月，FDA批准的生物技术药物有4个经PEG修饰化学修饰酶的药用价值提高热稳定性——工业用酶改善酶学性质——工业用酶改变最适pH值——工业用酶/药用酶提高对各类失活因子的抵抗力——工业用酶/药用酶消除抗原性——药用酶延长体内半衰期——药用酶改变组织分布能力——药用酶改变最适pH值酶修饰剂天然酶修饰酶猪肝尿酸酶白蛋白10.57.4-8.5糜蛋白酶肝素8.09.0吲哚-3-链烷羟化酶聚丙烯酸3.54.5-5.5猪肝尿酸酶PEG8.29.0改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力提高抗失活能力失活因子主要是水解酶和酶抑制剂过氧化氢酶：PEG修饰，抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解的能力明显提高尿激酶：白蛋白修后，抗胃蛋白酶水解和抗胎盘抑制剂的能力都增加可能机制：修饰剂产生空间屏蔽，有效地阻挡了水解酶或抑制剂的进攻，或者酶分子中对水解酶或抑制剂发敏感基团被修饰而起到了保护作用。改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力消除抗原性酶修饰剂抗原性精氨酸酶PEG消除尿酸酶PEG消除SOD人血清白蛋白消除-葡萄糖苷酶人血清白蛋白消除L-Asn酶PEG消除链激酶PEG降低改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力消除抗原性改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力PFG和人血清白蛋白：在消除酶的抗原性上效果比较明显，这是目前比较公认的；PVP修饰酶：在重复用于体内后，会诱导机体产生抗体而使酶失活；糖类物质（包括右旋糖苷）：亦不容易消除酶的抗原性，在体内仍可诱发过敏反应。修饰酶的抗原性与修饰剂有关：延长体内半衰期酶修饰剂天然酶修饰酶精氨酸酶右旋糖苷1.4h12h尿酸酶白蛋白4h20hSOD白蛋白6min4h腺苷酸脱氢酶PEG30min28hL-Asn酶PEG2h24h改变最适pH值提高抗失活能力消除抗原性延长体内半衰期改变组织分布能力改变组织分布能力一些酶经化学修饰后，对组织的分布能力就有所改变，能在