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毕业设计（论文）开题报告（学生填表）学院：2015年03月20日课题名称两种检测方法在肺结核病诊断中的临床价值学生姓名专业班级课题类型论文指导教师职称课题来源科研1.设计（或研究）的依据与意义结核病是一个全球性的重要的公共卫生问题，据WHO报道，每年约有800万新病例发生，至少有300万人死于该病。尤其是在最近十年，结核病在全球疫情又呈上升趋势，对一些国家已构成严重的健康威胁。因此，准确、快速及简便的早期诊断技术是目前结核病控制中的亟待解决的关键问题，常用的检测方法有胸片、CT等影像学检查、病原学检查、结核菌素（现一般用PPD）试验、抽血查结核抗体等，各种方法各有其优缺点，本文着重介绍结核分枝杆菌T细胞斑点法与荧光定量PCR两种检测方法在结核病诊断中的临床应用。一、结核病的概述（一）结核病的定义结核病（Tuberculosis，简称TB）是常见并可致命的一种传染病，由结核分枝杆菌复合群（Mycobacteriumtuberculosiscomplex，简称结核分枝杆菌或结核菌）引起的慢性感染性疾病，可累及全身多器官系统。肺结核是由于结核杆菌在肺部感染所引起的一种对健康危害较大的慢性传染病，占各器官结核病总数的80%～90%。（二）结核病的流行病学1、传染源结核病的传染源主要是痰涂片或培养阳性的肺结核患者，其中尤以涂片阳性肺结核的传染性为强。2、传播途径结核菌主要通过呼吸道传染，活动性肺结核患者咳嗽、喷嚏或大声说话时，会形成以单个结核菌为核心的飞沫核悬浮于空气中，从而感染新的宿主。此外，患者咳嗽排出的结核菌干燥后附着在尘土上，形成带菌尘埃，亦可侵入人体形成感染。经消化道、泌尿生殖系统、皮肤的传播途径极少见。3、易感或促发因素易感或促发因素指对结核病感染、发病、患病的易感或促发因素。了解这些因素有助于加深对结核病病因、发病和流行的理解，对结核病的临床诊治和预防控制都有重要意义。（1）遗传因素研究表明，同卵双胞胎患结核病时其结果一致性比例远高于异卵双胞胎者，证明遗传因素对结核病患者有肯定的影响[4]。个体对结核病易感性或抗性的差异与宿主某些基因相关。现已筛选出多种人的结核病相关候选基因，例如三类HLA基因区多态性与结核病易感性的关系在国内外均有报道，以Ⅱ类基因为多；在非洲和亚洲人群中的研究表明人类SLC11A1基因多态性与结核病易感性相关[4]。（2）年龄我国三次流行调查结果显示20岁以下患病率随年龄快速增长，以后为平缓增长至70岁达高峰，再后又下降。（3）性别20岁前患病率女性高于男性，其后男性高于女性，其显示年龄性别都对结核病发病、患病有肯定的影响。产后妇女易发结核病尤其是血源性结核和结核性脑膜炎。（4）职业某些职业与结核病密切相关。如粉尘业矽肺多发且矽肺者易患结核病，长期从事护理工者结核菌素阴性者其患病率高于已阳性者10倍。（5）药物与结核病皮质激素类、免疫抑制剂常造成隐性结核，如：哮喘长期用激素者、脏器移植长期应用激素与免疫抑制剂者、恶性肿瘤行手术及化疗者即为此类。近年这些情况更有增多，糖尿病、肝肾疾病、胃大部切除术后、流感、麻疹、百日咳感染后，都易发结核病；恶性肿瘤影响淋巴细胞免疫者，如淋巴瘤、白血病、获得性免疫缺陷综合症（简称艾滋病，AcquiredImmuneDeficiencySyndrome，AIDS）等均易患结核病。80年代中期以来，美国结核患病率回升，其1/3归因于AIDS的流行。（6）营养不良、过度劳累使抵抗力下降也易患结核病。（7）流动人口、难民、移民因生活不安定、营养差、疲劳、居住拥挤而易于感染、患病。（8）恶劣的社会环境因素如贫穷、战乱、饥荒、自然灾害等。（三）肺结核诊断标准1、传染性肺结核诊断标准（1）2次痰液涂片抗酸杆菌（＋）或痰培养分枝杆菌（＋）（2）胸X线片有肺结核特征病灶2、结核菌阴活动性肺结核诊断标准（1）涂片或培养2次以上（－）（2）胸部X线片示活动性肺结核征象（3）咳嗽、咳痰、血痰或咯血、胸闷、气短、胸痛、疲乏、低热、食欲不振、体重减轻、月经失调（4）5单位PPD－T或OT皮内注射72h局部硬结反应≥5mm（5）肺部标本（手术、纤维支镜检查、肺穿）有记录诊断为结核3、可疑肺结核诊断指征（线索指征）（1）咳嗽、咳痰或痰血、咯血2周（3周）以上，可伴有纳差、发热、消瘦、乏力、盗汗或者胸痛、气短。（2）既往有肺结核或胸膜炎历史未治疗或者未认真治疗。（3）有与传染性结核病人密切接触者父母、近亲、近邻、同室、同班、同组、有肺结核或类似肺结核症状者。（4）有可疑肺结核症状或肺外结核如胸廓内陷、泡性结膜炎、结节性红斑、肛瘘或存在于脊椎关节、肾与附睾、颈腋淋巴结、脑膜、心包膜、腹盆腔某一部位的结核。（5）有某些结核病易患因素者糖尿病、矽肺、肝肾病、胃切除后；产褥期女性、60岁以上老人、淋巴瘤、白血病、艾滋病或HIV感染者。（6）有某些结核病诱发因素者如哮喘、肿瘤、脏器移植或变态反应性疾病有长期使用皮质激素或免疫抑制剂者。（7）结核菌素新近阳转的儿童与医院工作的护士。（8）移民、新入城市的打工者、就业者、高中、大学毕业班学生。（四）结核病的病理病因1、结核病的病理改变（1）结核病的基本病理改变分以下三种①渗出性病变渗出性病变表现为充血、水肿与白细胞浸润。早期渗出性病变中有嗜中性粒细胞，以后逐渐被巨噬细胞和淋巴细胞所代替。在巨噬细胞内可见到被吞噬的结核菌。渗出性病变通常出现在结核炎症的早期或病灶恶化时，亦可见于浆膜结核。当病情好转时，渗出性病变可完全消散吸收。②增殖性病变增殖性病变开始时可有一短暂的渗出阶段。当巨噬细胞吞噬并消化了结核菌后，菌的磷脂成分使巨噬细胞形态变大而扁平，类似上皮细胞，称“类上皮细胞”。类上皮细胞具有吞噬作用，胞浆内含有多量酯酶，能溶解和消化结核菌。类上皮细胞是增殖性改变的主要成份，在结核病诊断上具有一定的特异性。类上皮细胞聚集成团，中央可出现朗汉斯巨细胞。类上皮细胞、朗汉斯巨细胞和淋巴细胞浸润，形成了典型的类上皮样肉芽肿结节，为结核病的较具特征性的病变。这种结节形成的过程，就是巨噬细胞吞噬、杀死结核菌，使病变局限化，以防止细菌播散的过程。大多数结核菌在类上皮样肉芽肿结节形成过程中已被消灭，抗酸染色时，结节内一般查不到结核菌。增生为主的病变多发生在结核菌量较少、人体细胞免疫系统占优势的情况下。③干酪样坏死干酪样坏死常发生在渗出或增生性病变的基础上。若机体抵抗力降低、结核菌量过多、变态反应强烈，渗出性病变中结核菌战胜巨噬细胞后不断繁殖，使细胞混浊肿胀后，发生脂肪变性，溶解碎裂，直至细胞坏死。炎症细胞死后释放蛋白溶解酶，使组织溶解坏死，形成凝固性坏死。因含多量脂质使病灶在肉眼观察下呈黄灰色，质松而脆，状似干酪，故名干酪样坏死。镜检可见一片凝固的、染成伊红色的、无结构的坏死组织。在质硬无液化的干酪坏死物中，结核菌由于缺氧和菌体崩解后释放出脂酸，抑制结核菌的生长，故很难找到。干酪坏死物质在一定条件下亦可液化，其机制尚不完全清楚，可能与中性白细胞分解产生的蛋白分解酶有关，亦可能与机体变态反应有关。干酪液化后，坏死物质就沿支气管排出或播散到其它肺叶，造成支气管播散。原干酪灶演变成空洞，并有大量结核菌生长繁殖，成为结核病的传染源。上述三种病变可同时存在于一个肺部病灶中，但通常以其中一种为主。例如在渗出性及增殖性病变的中央，可出现少量干酪样坏死；而变质为主的病变，常同时伴有程度不同的渗出与类上皮样肉芽肿结节的形成。（2）结核病病理的特征性改变结核结节与干酪性坏死。结核结节由朗汉斯巨细胞、上皮样细胞、淋巴细胞构成，中心可有干酪坏死。干酪性坏死大体观察类似干酪，镜检为凝固的伊红色的无结构的坏死组织。结核病的转归有两个方面，一方面是恶化，表现为渗出扩展、干酪化、溶解形成空洞、支气管播散；另一方面是好转，表现为吸收消散、纤维硬结、钙化。2、结核病的病因引起结核病的病原菌是结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis，TB）又称结核杆菌。（1）生物性状结核分枝杆菌为细长略带弯曲的杆菌，大小（1～4）×0.4μm。牛分枝杆菌则比较粗短。杆菌属的细菌细胞壁脂质含量较高，约占干重的60%，特别是有大量分枝菌酸(mycolicacid)包围在肽聚糖层的外面，可影响染料的穿入。分枝杆菌一般用齐尼抗酸染色法，以5%石炭酸复红加温染色后可以染上，但用3%盐酸乙醇不易脱色。若再加用伊红美蓝染料复染，则分枝杆菌呈红色，而其他细菌和背景中的物质为蓝色。在电镜下可看到菌体外有一层较厚的透明区，即荚膜，一般因制片时遭受破坏而不易看到，若在制备电镜标本固定前用明胶处理，可防止荚膜脱水收缩，荚膜对结核分枝杆菌有一定的保护作用。结核分枝杆菌在体内外经青霉素、环丝氨酸或溶菌酶诱导可影响细胞壁中肽聚糖的合成，异烟肼影响分枝菌酸的合成，巨噬细胞吞噬结核分枝杆菌后溶菌酶的作用可破坏肽聚糖，均可导致其变为L型，呈颗粒状或丝状。异烟肼影响分枝菌酸的合成，可变为抗酸染色阴性。这种形态多形染色多变在肺内外结核感染标本中常能见到。（2）培养特性专性需氧，最适温度为37℃，低于30℃不生长。结核分枝杆菌细胞壁的脂质含量较高，影响营养物质的吸收，故生长缓慢。在一般培养基中每分裂1代需时18～24h，营养丰富时只需5h。生化反应：结核分枝杆菌不发酵糖类。与牛分枝杆菌的区别在于结核分枝杆菌可合成烟酸和还原硝酸盐，而牛分枝杆菌不能。热触酶试验对区别结核分枝杆菌与非结核分枝杆菌有重要意义。结核分枝杆菌大多数触酶试验阳性，而热触酶试验阴性；非结核分枝杆菌则大多数两种试验均阳性。（3）抵抗力结核分枝杆菌细胞壁中含有脂质，故对乙醇敏感，在70%乙醇中2min死亡。此外，脂质可防止菌体水分丢失，故对干燥的抵抗力特别强。粘附在尘埃上保持传染性8～10d，在干燥痰液内可存活6～8个月。结核分枝杆菌对湿热敏感，在液体中加热62～63℃、15min或煮沸即被杀死。结核分枝杆菌对紫外线敏感。直接日光照射数小时可被杀死，可用于结核患者衣服、书籍等的消毒。结核分枝杆菌的抵抗力与环境中有机物的存在有密切关系，如痰液可增强结核分枝杆菌的抵抗力。因大多数消毒剂可使痰中的蛋白质凝固，包在细菌周围，使细菌不易被杀死。5%石炭酸在无痰时30min可杀死结核分枝杆菌，有痰时需要24h。结核分枝杆菌对酸（3%HCl或6%H2SO4)或碱（4%NaOH)有抵抗力，15min不受影响。可在分离培养时用于处理有杂菌污染的标本和消化标本中的粘稠物质。（4）耐药性结核分枝杆菌对链霉素、异烟肼、利福平、环丝氨酸、乙胺丁醇、卡那霉素、对氨基水杨酸等敏感，但长期用药容易出现耐药性，而吡嗪酰胺的耐药性＜5%。不同生长速度和环境的结核菌对抗结核药的敏感性不同，Murchison将结核菌按生长情况和对药物反应情况分为四个菌群：Ａ菌群代谢旺盛快繁殖菌，如为空洞中菌，数量大，传染性强，但易被抗结核药物杀灭。B菌群为慢繁殖菌，C菌群为间歇繁殖菌，这类结核菌存在于酸性环境，如急性炎症区或吞噬细胞内（pH值５左右），仅对少数药物如吡嗪酰胺敏感，或在其间歇生长繁殖时对药物敏感。这类结核菌由于不易被杀灭也称为顽固菌，是日后复发的根源，也是抗结核化疗疗程不能进一步缩短的障碍。Ｄ菌群为休眠菌，对药物不敏感，但数量少，逐渐被吞噬细胞所消灭。（5）变异性结核分枝杆菌可发生形态、菌落、毒力、免疫原性和耐药性等变异。（6）致病性质致病物质与荚膜、脂质和蛋白质有关。结核分枝杆菌不产生内、外毒素。其致病性可能与细菌在组织细胞内大量繁殖引起的炎症，菌体成分和代谢物质的毒性以及机体对菌体成分产生的免疫损伤有关。（五）结核病的发病机制1、结核分枝杆菌的致病性和毒力结核菌的毒力与类脂质如硫脂质有关，类脂质不仅增加了索状因子的毒性，且抑制溶酶体－吞噬体的融合，促进结核菌在巨噬细胞内的生长繁殖。磷脂能够刺激机体内单核细胞的增殖、类上皮细胞化、朗汉斯巨细胞的形成。蜡质D是分枝菌酸、阿糖阗乳聚糖与粘肽相结合的复合物，具有佐剂活性，刺激机体能产生免疫球蛋白，对结核性干酪病灶的液化、坏死、溶解和空洞的形成起重要作用。除了以上的类脂质成分外，