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马玉超北京林业大学生物科学与技术学院办公地点：生物楼117；电话：62336016；Email:myc0307@gmail.com现代微生物学实验技术实验内容♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列♣转座子随机突变及目的表型的筛选♣大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导♣利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性♣绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取转座子随机突变及目的表型的筛选李丽萍实验目的1.了解细菌常见转座子Tn5的结构及转座机理2.学习利用转座子进行随机插入突变的实验过程3.掌握双亲接合实验的原理及过程实验原理转座子：转座因子或跳跃因子，它可以从遗传物质的一部分跳跃到另一部分，从而引起遗传变异。转座子的发现：20世纪50年代初期，美国冷泉港实验室遗传育种学家McClintock通过对玉米籽粒色斑不稳定现象的研究而发现转座现象，首次发现了能在基因组内不同区域转移的控制成分。实验原理细菌转座子的类型：插入序列(Insertionsequence);复合转座子(Compositetransposons);Tn5TnA转座子家族(TnAfamily);可移动噬菌体(Muphage).实验原理Tn5：发现于E.coli，序列全长5818bp。核心序列：编码三个抗生素(新霉素、博莱霉素、链霉素)；两个倒置的IS50：IS50R编码53KD的Tnp和48KD的转座阻遏蛋白(Inh),两者使用同一阅读框，但启动子不同。IS50L的第1442碱基处存在一个赭石突变，IS50具有19bp的倒置末端，二者有7个碱基不相同，是转座酶(Tnp)的作用位点。kanrstrrbleorOEIEIEOEIS50LIS50RP1(Tnp)P2(Inh)P3P4突变位点(Mutationsite)Tn5的转座机理实验原理实验原理DNAsequencing实验原理非转移性质粒：转移性质粒：能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移;接合作用：质粒在细菌间的转移，需要供体和受体细胞间的直接接触才能进行.受体菌，ApNx巴西固氮螺菌Sp7供体菌S17-1质粒pRL1063a,Km重组巴西固氮螺菌，ApNxKm实验原理植物生长激素，由植物根系细菌合成，对植物的生长及一些发育阶段的调控起关键作用细菌中IAA合成的几种途径A-B：吲哚乙酰胺途径；E-F-D：吲哚丙酮酸途径；C-D：色氨酸侧链途径实验材料1.菌株E.coliS17-1/pPRL1063a;巴西固氮螺菌sp72.培养基及试剂(1).细菌丰富培养基LB培养基LD培养基胰蛋白胨(g)1010酵母提取物(g)55氯化钠(g)102.5pH7.06.8固体培养基加入1.3%琼脂粉，dH2O定容至1L，121℃灭菌20min(2).用于IAA摇瓶培养的培养基(MAZ培养基)(3).抗生素抗生素名称贮存液配制方法氨苄青霉素(Ap)100mg/ml水溶液，-20℃25μg/ml卡那霉素(Km)100mg/ml水溶液，-20℃50μg/ml30-50μg/ml萘啶酮酸(Nx)20mg/ml水溶液，-20℃5μg/mlE.coliA.brasilense使用浓度3.主要仪器小型离心机实验步骤第一天：中午12：30～13：30接种sp7至5mlLD液体培养基中，30℃振荡培养约20小时。晚5：30，接种供体菌pRL1063a/E.coilS17-1至5mlLB+Km液体培养基中，37℃振荡培养约16小时。第二天：上午9：00，用同一个1.5ml离心管收集适量供体菌和受体菌。12000rpm离心30sec，弃上清，用移液器将菌泥悬浮混匀后移入LD平板中央，尽量减少气泡的产生。30℃正置培养过夜。注意：事先准备好LD平板第三天：用液体LD培养基洗下菌泥，铺于同时含有Km、Ap、Nx的LD平板上，30℃培养，筛选接合子。第四天：挑取接合子在含有上述三种抗生素的LD培养基平板上划线分离，保证得到的为单菌落。第五天：挑单菌落分别接种于5mlMAZ培养基中30℃摇瓶培养（野生菌对照）.第六天：用比色法测定菌液中的IAA含量。比色试剂：含12g/LFeCl3的H2SO4注意安全取1ml测量OD600；取1ml菌液12000rpm离心5min后取上清与比色试剂等量混合，摇匀后在暗处放置30min，然后测OD540nm注：空白对照，未接菌的培养基与比色用试剂的混合液。标准曲线实验结果菌株(Strains)(OD600)(OD540)IAA浓度(μg/ml)ck(培养基)Sp71-11-21-31-4表巴西固氮螺菌Yu62野生型及突变体的IAA产量●下次实验大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导