WB实验操作流程

WesternBlot实验操作指南WesternBlot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的特定蛋白进行显影。通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。实验流程主要包括以下几个步骤：样品制备；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。实验器材操作步骤样品制备准备进行westernblot的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。样品为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性对其进行提取。根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。（1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml4℃预冷的PBS（0.01MpH7.2～7.3）。平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。3、按1ml裂解液加10μlPMSF（100mM），摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于4℃下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。（2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取：1.将100mg组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS洗涤两次后，4℃，700×g（3000rpm)离心3min，弃上清。20mg组织加入100μl裂解液，置玻璃匀浆器冰上均质30～50次。(如使用组织匀浆机，则按照20mg组织加入100μl裂解液的比例加入裂解液。每个试管加入2个直径2mm的磁珠。将试管放入组织匀浆机中，60HZ，300s。充分裂解后，10000g离心5min，取上清。)2.最大速度涡旋震荡10sec，冰上放置20min，期间取出震荡3-5次,再于4℃，12000rpm离心10min，以沉淀组织或细胞碎片，取上清。生工相关产品：产品编号产品名称产品编号产品名称C510001细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒C500005、C510006、C500007、C500008RIPA裂解液I~IVC510002膜蛋白、核蛋白和胞质蛋白抽提试剂盒C510003动物全蛋白提取试剂盒C510005膜蛋白和胞质蛋白提取试剂盒C500058石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒C500009细胞核蛋白质提取试剂盒C500049膜蛋白提取试剂盒C500051胞质和线粒体蛋白质提取试剂盒C500073亚细胞结构蛋白提取试剂盒C500053植物蛋白提取试剂盒C510020一步法昆虫细胞活性蛋白提取试剂盒C510004一步法植物活性蛋白质提取试剂盒C500023一步法细菌活性蛋白提取试剂盒C500006一步法动物组织活性蛋白提取试剂盒C500026一步法酵母活性蛋白提取试剂盒C500022一步法动物细胞活性蛋白提取试剂盒蛋白定量蛋白定量是做WB实验的基础。蛋白定量的目的是：保证同一组中的不同样本的蛋白总量保持一致，只有这样，wb结果的内参、灰度等数据才可信。否则实验数据没有参考价值。蛋白定量的方法很多，常用的有Lowry法、BCA法、紫外吸收法、Biuret法、这些方法各有优缺点。应该按照具体实验选择不同的实验方法进行蛋白定量。示例：BCA法蛋白定量1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。2.完全溶解蛋白标准品，取10ul稀释至100ul，使终浓度为0.5mg/ml。蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。但是为了简便起见，也可以用0.9%NaCl或PBS稀释标准品。3.将标准品按0,1,2,4,8,12,16,20ul加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20ul。4.加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液至20ul。5.各孔加入200ulBCA工作液，37℃放置30分钟。注:也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显影反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。6.测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。凝胶电泳Westernblot通常使用SDS-PAGE进行电泳。根据自身蛋白的分子量选择SDS-PAGE的浓度，如蛋白分子量未知可以选择梯度凝胶。可以选择自制聚丙烯酰胺凝胶或购买预制胶。以SDS-PAGE10%自制胶为例，准备进行凝胶电泳：1.根据蛋白的分子量确定好SDS-PAGE胶的浓度，装配好灌胶的模具。2.进行分离胶的配置，取一个烧杯，按照配方加入适量的聚丙烯酰胺溶液，10%SDS，分离胶缓冲液，混匀。加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（注：不要产生气泡），将此液体缓慢加入到模具内。3.加入分离胶后轻轻在分离胶溶液上覆盖上水。4.等待30~60min，待凝胶聚合后，分离胶和水层出现一个清晰的界面，吸尽分离胶上的水。5.进行浓缩胶的配置，取一个烧杯，按照配方加入适量的聚丙烯酰胺溶液，10%SDS，浓缩胶缓冲液，混匀。按照配方加入适量的过硫酸铵和TEMED，轻轻搅拌（注：不要产生气泡），将此液体缓慢加入到分离胶的上面，直至灌满，将梳子插入凝胶内（保证梳子齿末端没有气泡）。6.等待30min左右，待凝胶聚合后小心拔出梳子，将制好的凝胶及玻璃板放入电泳槽内并组装好。7.将电泳缓冲液加入内外槽中，使凝胶的上下两端均能浸泡在电泳缓冲中。8.将制备好的样品与上样缓冲液按比例混合，95℃~100℃加热3~5min，取15ul(可根据试验情况进行调整)将样品加入到凝胶孔中，同时必须在同一片胶的孔中加入蛋白marker作为参照。9.接通电源进行电泳，观察marker，待maker显示的目标蛋白与其他蛋白明显分离停止电泳，一般情况下是等溴酚蓝标记的样本跑出凝胶，目标蛋白的分子量不同电泳停止的时间不同，视实验而定。生工相关产品：产品编号产品名称产品编号产品名称C631100SDS-PAGE变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒C621100Precast-GL预制胶7.5%10孔（用于变性电泳）C621101Precast-GL预制胶10%10孔（用于变性电泳）C621102Precast-GL预制胶12%10孔（用于变性电泳）C621103Precast-GL预制胶15%10孔（用于变性电泳）C621104Precast-GL预制胶4~15%10孔（用于变性电泳）C621105Precast-GL预制胶4~20%10孔（用于变性电泳）C5083205x蛋白质加样缓冲液C50602310xTris-GlycineGelRunningBufferC610011TureColor双色预染蛋白MarkerC600525蛋白非预染MarkerIV，中分子量范围C600524蛋白非预染MarkerIII，中分子量范围转膜转膜是将蛋白质从聚丙烯酰胺凝胶转移到膜上的过程。转膜的方法可分为半干转和湿转，湿转法转膜效率较高，使用转膜液多，转膜时需要冷却，半干转转膜时间短，需要的转膜液少，不适合转移高分子量蛋白质。膜可以选择PVDF膜和NC膜。PVDF膜与目的蛋白结合能力较高，灵敏度高，不易破碎，可适用于再次标记（使用前需要浸泡在甲醇中激活）。NC膜不需要甲醇激活但易破碎。膜的规格有0.45μm和0.2μm两个规格，大于20kd的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kd的蛋白要用0.2μm的膜。NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低结合能力80－110ug/cm2400ug/cm2125－200ug/cm2（适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC膜易脆软而结实机械强度高溶剂耐受性无无有操作程序缓冲液润湿,避免气泡缓冲液润湿使用前100%甲醇润湿适用范围0.45um一般蛋白0.2um一分子量小于20kD蛋白0.1um一分子量小于7kD蛋白低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白和蛋白多糖(主要用在核酸检测中)糖蛋白检测和蛋白质测序价格价格较便宜便宜较贵以PVDF膜，湿转为例（仅供参考）：1.准备好转膜液，将胶浸于转膜缓冲液10min左右。2.根据胶的大小剪PVDF膜（使用前需要用甲醇处理）和滤纸，放到转膜缓冲液中平衡10min左右。3.装配转膜，在海绵上放置3层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置胶，放置处理好的PVDF膜，放置3层已经用转膜液浸泡过的滤纸，放置海绵，注意每层之间都不能有气泡，用转膜仪中的支架夹住。（胶位于负极）4.将转膜“三明治”放置到转膜槽中，加转膜缓冲液，将转移槽置于冰浴中。插上电极，根据蛋白分子量确认转膜的电压/电流，时间。5.转膜结束后，切断电源，取出PVDF膜。注：转膜后可能分不清膜的方向，可在膜上剪角，有利于判断膜的方向。生工相关产品：产品编号产品名称产品编号产品名称C52000310X印迹膜专印缓冲液C5060441XTris-CAPS印迹膜转印缓冲液C52003910X高分子量印迹膜转印缓冲液C620393WesternBlot试剂盒（兔），带PVDF膜C610393WesternBlot试剂盒（大鼠），带PVDF膜C600393WesternBlot试剂盒（小鼠），带PVDF膜C520005丽春红染色溶液，5X封闭及免疫杂交为了防止抗体和膜非特异性的结合，加入封闭试剂将其他未结合蛋白的区域进行封闭。封闭的操作步骤（仅供参考）：1.用适量的TBS/PBS洗已经转好的膜，室温，放到摇床上晃动。2.将膜置于约25ml封闭缓冲液中1h，室温，置于摇床上晃动。3.15mlTBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约5min）。4.加入稀释过的一抗，室温孵育1~2h或4℃过夜，缓慢晃动。5.用15mlTBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约5min）。6.加入稀释过的二抗，室温孵育1h，缓慢晃动7.用15mlTBS/T或PBS/T洗膜三次（每次约5min）。（注:最后一次要用不含tween的溶液清洗）注：实验的条件可根据实验情况进行调整。生工相关产品：产品编号产品名称产品编号产品名称C520035WBBSA封闭液体（1XinPBS）C530040WB无蛋白封闭液，2%C500036WBBSA封闭液体（1XinTBS）C520041WB无蛋白封闭液，1%in1XPBSC52000210xTBSWB漂洗液C510042WB无蛋白封闭液，1%in1XTBSC52000910xTBSTWB漂洗液C52000410xPBSTWB漂洗液C51000810xPBSWB漂C5200112xWB一抗/二抗洗液稀释液（inPBS）显影显影的方法包括化学发光法以及生色底物显影法进行实验。因为二抗上标记分为有HRP（辣根过氧化物酶）以及AP（碱性磷酸酶），两种二抗可供选择的方法也不同。标记HRP（辣根过氧化物酶）的二抗：化学发光底物：一般使用ECL发光法进行实验，ECL中含有H2O2和鲁米诺，在HRP（辣根过氧化物酶）的作用下，发出荧光来。生色底物：HRP的生色底物显影有DAB，4-CN，CN/DAB，AEC和TMB等。标记AP（碱性磷酸酶）的二抗：AP的生色底物：BCIP，NBT和INT。以标记HRP（辣根过氧化物酶）的二抗,DAB显影（C520017辣根过氧化氢酶DAB显影试剂盒）为例：1.经二抗标记及清洗过的膜放在阴暗处。显影前，配置新鲜的DAB显影液并充分混匀。2