第四章 转录后加工

细胞内的RNA组分第四章转录后加工转录后的加工（posttranscriptionalmodification）（1）减少部分片段：如切除5′端前导序列，3′端拖尾序列和中部的内含子；（2）增加部分片段：5′加帽，3′加poly(A),通过编辑加入一些碱基；（3）修饰：对某些碱基进行甲基化等。第一节tRNA和rRNA的加工一.原核的tRNA和rRNA的加工参与蛋白质合成的tRNA和rRNA都不是最初的转录产物(1)它们的5′端都是单磷酸，而原始的转录产物5′应是三磷酸；(2)分子比初始转录物小；(3)tRNA含有特殊的碱基，这些碱基只有通过一些化学修饰才可以得到。（4）每个转录单位由16SrRNA、23SrRNA、5.8SrRNA以及一个或几个tRNA基因所组成。（一）、rRNA的加工tRNAIletRNAAlatRNAAsptRNATrp16S23S5SRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseIIIRNaseRRNaseRRNaseRRNaseRRNaseRrRNA的加工(二)tRNA的加工tRNA的加工分成3个阶段(1)“斩头”，形成5′末端；(2)去尾，形成3′-OH末端。缺-CCA的tRNA要用tRNA核酸转移酶加-CCA。(3)修饰：通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等进行修饰，如氨基酸臂的4-硫尿苷（4tu），D臂的2甲基鸟苷（2mG），TψC臂的假尿苷（ψ）和反密码子环上的2异戊腺苷（2ipA)tRNA+CTPtRNA-C＋PPitRNA-C+CTPtRNA-C-C＋PPitRNA-C-C+ATPtRNA-C-C-A＋PPitRNA核苷酰转移酶tRNA+SAM甲基-tRNA+S-酰苷高半光氨酸tRNA甲基化酶二真核的tRNA和rRNA的加工真核tRNA的基因和原核不同：(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区；(2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母约有400个tRNA基因；(3)5′端单磷酸核苷酸，表明已被加工过；(4)tRNA的前体分子中含有内含子。真核tRNA内含子的特点：①位置相同，都在反密码子环的下游；②不同tRNA的内含子长度和序列各异；③外显子和内含子交界处无保守序列；④内含子的剪切是依靠RNase异体催化；⑤内含子和反密码子配对形成茎环。有何意义？成熟的tRNA前体tRNACGGAAUGCmAYmCAUYGAA反密码子酵母tRNAPhe内含子的结构子CGGAAUGCmAYCGAUCUGGCAUAUGCAAAAAAUUAGAGAUC真核tRNA内含子切除的特点：(1)没有交界序列，也没有内部引导序列；(2)剪切反应的信号是二级结构，而不是一级结构；(3)是依赖于蛋白质性的RNase，而不是核糖拟酶或snRNP；(4)反应的本质不是转酯反应。1加野生型酵母细胞提取物凝胶电泳前体tRNA内含子图13-酵母tRNA在体外的剪切酵母tRNA前体内含子3’和5’端的剪切是由内切酶的不同亚基催化的。亚Sen34,Sen15剪切3’端，Sen54可能通过量度成熟结构的距离来决定5’端剪切位点的位置。13’3’3’3’5’核酸酶5’折叠5’连接5’OH5’3’OH5’OH2’－3’P2’－3’PtRNA链O碱基O碱基OHPCH2O碱基CH2O碱基OOOHOPOPOOHOHOOOtRNA链tRNA链2’－3’环磷酸3’－OH,2’磷酸环磷酸二酯酶打开2′-3′环磷酸激酶使5′-OH磷酸化真核tRNA的加工和原核的区别(1)真核tRNA前体中无二聚体和多聚体；(2)增加了剪接内含子的过程；(3)都要加CCA。真核细胞中rRNA的加工途径(1)切除5′端的前导序列；(2)从41S的中间产物中先切下18S的片段。Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序列）；L细胞的切点在18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。(3)部分退火，形成发夹结构；(4)最后修正。1剪切位点5’3’18S5.8S28S人类HeLa细胞途径：小鼠L细胞途径：45S41S41S32S36S20S18S18S32S28S－5.8S28S－5.8SC框D框H框ACA框rRNA的加工和修饰需要snoRNAs(smoallnucleolarRNAs)在酵母和爪蟾转录间隔区5’的剪切需要U3snoRNA.脊椎动物rRNA含1002’-O-甲基位点，它们的甲基化需要snoRNA的C/DBox,snoRNA和RNA的配对区将成为甲基化的催化区snoRNA的另一些区域涉及到的产生。酵母rRNA43的产生即为一例。它需要CACsnoRNA，当CACsnoRNA发生缺失或突变则不能产生第二节前体mRNA的加工mRNA前体分子的加工主要是真核mRNA，原核的mRNA一般不经过加工。真核mRNA的加工一般要经过四步：(1)5′加帽；(2)3′加尾；(3)切除内含子；(4)修饰：对某些碱基进行甲基化。一原核生物mRNA的加工P早期转录基因A1A2A30.30.711.11.21.3tRNaseⅢpppPuCoHpppPu前导序列0.30.711.1/1.21.3mRNAT7噬菌体早期区转录单条前体RNA，经RNaseⅢ剪切成5条成熟的mRNA1AUGCCGCUACGGUCGUGCGGCAUAUCUUAURNaseⅢCGAAGUAUUAAUGCUA0.3mRNAGC0.7mRNAAUGUGAAUCUGCUCUACUUAUGAGRNaseⅢ在T7茎环上的典型切割位点(GENESVIFig12.47)1E．coli90’/100’处rplJ(L10)rplJ(L10)rpoB(β亚基)rpoC(β’亚基)转录前体多顺反子mRNARNaseⅢ加工成熟的mRNA23SrRNA～2900ntAACGGCAUAUUAUAGCGCAUGUUAGCUAUAGCGRNaseⅢGCGCCGRNaseⅢUAUACGUGAUCGAUAUAUGU5’3’RNase在前体rRNA茎上的剪切位点(GENESVIFig12.51)二真核mRNA前体的加工(一)核内不均一RNA（heterogenousnuclearRNA,hnRNA）平均分子长度为8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均长度（1.8-2Kb）要大4-5倍。hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。hnRNA是mRNA的前体，证据是：(1)hnRNA和mRNA有相同的序列；(2)hnRNA在体外能作为模板翻译蛋白；(3)两者5′端都有帽子结构；(4)表明二者为相同的聚合酶所合成；(5)两者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。hnRNA的结构的特点(1)5′端有帽结构；(2)3′端有poly（A）尾巴；(3)帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt；(4)有重复序列，位于寡聚U区后面；(5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧；(6)非重复序列中有内含子区。5’m7pppNmNUUUUAAAAA……3’寡聚U区ds单一序列dsPoly(A)RNARNAhnRNA的结构模型1．加帽(1)剪接前加帽如呼肠病毒，牛豆病毒(2)剪切后加帽如疱疹病毒和口炎病毒GN1N2N3GN1N2N3磷酸水解酶PPPPPPP…PPPPPP…＋PiGN1N2N3GmRNA鸟苷脱酰转移酶PPPPPP…＋PPPOH加帽酶GGN1N2N3SAMOHPPPPPPP…＋PPi(S-腺苷基甲硫氨酸)7mGmGmN1N2N3OHPPPPPPP…真核生物剪切前加帽的生化反应过程GN1N2N3N1N2N3PPPP…PPPP…PPPP…GN1N2N3GN1N2N3＋＋PiPPPOHPPPP…PPPPPPP…GN1N2N3SAM7mGN1N2N3PPPPPPP…PPPPPPP…真核生物剪切后加帽的生化反应过程帽子的类型在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子（capO）；在次末端核苷酸的核糖上的2′-0位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap1)；此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-0）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）。这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontdenucleotidestructure）。三种帽子的共同在帽1中可被甲基化NH2位置CNOCH3NCCHCNHCCHNCNNCHOCOOO2HNNNCH2OPOPOPOCHOOO帽1位置OCH3OOPOCH2O帽2位置OCH3OOPOOmRNA5’端的帽子位置和可被甲基化的位点帽子结构的功能(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质；(2)保护5′不被酶降解；(3)翻译时供IFⅢ（起始因子）和核糖体识别。(2)加尾(1)特殊组分(CPSF)识别AAUAAA并指导其它的活性(2)剪切因子(CF)在加尾位点AAUAAA下游11－30nt处剪切RNA；(3)末端腺苷转移酶[poly(A)聚合酶]合成poly(A)尾巴；(4)PBP与poly(A)结合，反应停止。加尾●概念Apoly(A)tail(50-200±)beaddedat-20Nt±tailingsignal(AAUAAA)from3’-endofPre-RNARabbitα-globinmRNA5’-------CUUUGAAUAAA-----------poly(A)3’-20Rabbitβ-globinmRNA5’-------UGGCUAAUAAA-----------poly(A)3’-20Manα-globinmRNA5’-------CUUUGAAUAAA------------poly(A)3’-20Manβ-globinmRNA5’-------UGCCUAAUAAA------------poly(A)3’-20Proceedingofpre-RNAtailingRecognizingsiteCapCap特异内切酶识别AAUAAA及随后的GUGUGUG并在其间酶切，在3‘端聚合50-200poly(A)GUGUGUG加Poly(A)的反应第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列；反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。加上～200A后反应停止复合体解离5’3’CPSFCFⅡAAUAAACstFCFⅠPAP5’3’CPSFCFⅡAAUAAA3’CstF5’CFⅠPAPCPSFAAUAAAAAAAAA3’CstFPAPPBPCPSFAAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’CstFAAUAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA3’3’端加尾反应和相关的蛋白质因子CPSF：specificitycomponentCstF：剪切活化因子CF：cleavagefactorsPBP：Poly(A)结合蛋白(GENESVIFig.30.28)各种3’加工成分组装成复合体剪切因子(CF)产生3’端3’末端Poly(A)聚合酶(PAP)加APBP与Poly(A)结合有些mRNA的3’端无poly(A)尾，如在爪蟾卵母细胞中组蛋白H3的mRNA.成熟时要切除一段3’端序列。加工的要素是：(1)热敏因子，功能不祥；(2)剪切位点的发夹结构（和序列无关，与二级结构有关）；(3)U7snRNA,长56nt,其5’端有一保守序列和H3mRNA剪切点下游的GAAAGA互补。第三节内含子的剪接一.核酶(Ribozyme)1981年T.Cech和S.Atman等在研究四膜虫rRNA时发现的；T.Cech由核糖核酸（ribonucleicacid）和酶（enzyme）这两个词“重组”成一个新的词：“Ribozyme”；是指本质为RNA或以RNA为主含有蛋白质辅基的一类具有催化功能的物质。和传统酶的区别：(1)一般的酶是纯的蛋白质，而核酶是RNA或带有蛋白的RNA；(2)核酶既是催化剂又是底物。而酶仅催化