第四章 酶分子修饰

上节课主要内容回顾从酶的生产到酶的改性酶分子修饰所要解决的问题和修饰的目标酶分子修饰的种类侧链基团修饰酶的改性（enzymicimproving）：通过各种方法使酶的催化特性得以改进的技术过程。酶改性的技术酶分子的修饰酶固定化酶的非水相催化酶的定向进化……酶分子修饰通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。4.1概述2、酶分子修饰的原因细胞外稳定性差；酶活性不够高；具有抗原性。4.1概述4、酶分子修饰的目的研究酶的结构与功能的关系。人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）提高酶的生物活性（酶活力）。增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。产生新的催化能力。4.4酶分子的修饰方法金属离子置换修饰大分子结合修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰氨基酸侧链基团修饰剂Lys（赖）氨基三硝基苯磺酸，2,4-二硝基氟苯、碘乙酸、碘乙酰胺、丹磺酰氯、亚硝酸Asp、Glu（天冬、谷）羧基碳化二亚胺Arg（精）胍基苯乙二醛，1,2－环己二酮、丁二酮Cys（半胱）巯基碘乙酸、碘乙酰胺、N-乙基马来酰亚胺二硫键巯基乙醇、DTT（二硫苏糖醇）His（组）咪唑基焦碳酸二乙酯、碘乙酸Tyr（酪）酚羟基碘、四硝基甲烷Trp（色）吲哚基N-溴代琥珀酰亚胺各种氨基酸侧链的修饰剂4.酶蛋白主链修饰（肽链有限水解修饰）利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性和功能的方法。主链的切断修饰1）主链的切断引起酶活性中心的破坏，酶将丧失其活性。——主要用于探测酶活性中心的位置。2）主链切断后仍可维持酶活性中心的空间构象，酶的催化能力保持不变或损失不多，其抗原性等特性发生改变。——提高某些酶特性特别是药用酶的使用价值。3）主链切断有利于酶活性中心的形成，使酶分子显示其催化功能，使酶活力提高。——酶原——酶主链的切断修饰胃蛋白酶原胃蛋白酶N端失去44个氨基酸残基HClpH1.5～2自身激活a、胃蛋白酶原的激活5.酶组成单位置换修饰氨基酸置换修饰：将蛋白酶分子肽链上的某一个氨基酸换成另一个氨基酸的修饰方法。核苷酸置换修饰：将核酸类酶核苷酸链上的某一个核苷酸换成另一个核苷酸的修饰方法。（1）酶分子组成单位修饰的作用通过修饰可以提高酶活力通过修饰可以增强酶的稳定性通过修饰可以使酶的专一性发生改变通过核苷酸置换修饰可获得各种人造核酸类酶。如：酪氨酸-RNA合成酶反应：催化酪氨酸与其对应的tRNA反应生成酪氨酰-tRNA置换：将51位的苏氨酸换为脯氨酸结果：酶对ATP的亲和性提高近100倍，酶活力提高25倍。如：枯草杆菌的蛋白酶反应：催化蛋白质和多肽水解置换：活性中心上的丝氨酸换成半胱氨酸结果：酶对蛋白质和多肽的水解活性消失，出现催化硝基苯酯等底物进行水解反应的活性。采用核苷酸置换修饰技术将保守核苷酸以外的某个或某些核苷酸置换，就可以获得各种不同的人造核酸类酶。如：T4-溶菌酶置换：第3位的异亮氨酸换成半胱氨酸，半胱氨酸可与第97位的半胱氨酸形成二硫键。结果：酶活力保持不变，但酶对热的稳定性大大提高。氨基酸置换修饰的方法化学修饰法定点突变技术（2）定点突变技术在酶分子修饰中的应用定点突变（sitedirectedmutagenesis）：指DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变，从而获得突变基因的操作技术。是蛋白质工程（proteinengineering）和酶分子组成单位置换修饰中常用的技术。定点突变技术用于酶分子修饰的主要过程（P148）1.设计新酶分子结构设计新酶的RNA的核苷酸排列次序或酶蛋白的氨基酸排列次序，确定需置换的核苷酸或氨基酸及其位置。2.确定突变基因碱基序列酶RNA→互补原则→DNA序列酶蛋白→遗传密码→mRNA→DNA3.获得突变基因寡核苷酸诱导的定位突变。4.获得新酶获得基因体外重组后导入宿主内进行表达。6.酶分子的物理修饰通过物理修饰，可以了解不同物理条件下，特别是在极端条件下（高温、高压、高盐、极端pH值等）由于酶分子空间构象的改变而引起酶的特性和功能的变化情况。特点在于不改变酶的组成单位及其基团，酶分子中的共价键不发生改变，只是在物理因素的作用下，副键发生某些变化和重排。共价键与副键酶分子修饰的应用理论研究医学和工业应用酶的作用机制研究亲和标记法和差示标记法有机介质酶催化反应中的应用酶分子的修饰方法金属离子置换修饰大分子结合修饰侧链基团修饰肽链有限水解修饰氨基酸置换修饰酶分子的物理修饰氨基的修饰羧基的修饰巯基的修饰精氨酸胍基的修饰酪氨酸酚基的修饰组氨酸咪唑基的修饰色氨酸吲哚基的修饰分子内交联修饰4.6酶的定向进化定向进化：模拟自然进化的过程，进行人工随机突变，并在特定的环境条件下进行选择，使进化朝着人们所需方向发展的技术过程。定向进化分子定向进化细胞定向进化酶分子定向进化蛋白质分子定向进化核酸分子定向进化微生物细胞定向进化植物细胞定向进化动物细胞定向进化酶分子的定向进化（directedevolution）：模拟自然进化过程（随机突变和自然选择），在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程。属于蛋白质的非合理设计，它不需事先了解酶的空间结构和催化机制。4.6.1定向进化的特点适应面广；目的性强；效率高。4.6.2定向进化的原理以很低的比率向目的基因中随机引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出所需性质的优化酶(或蛋白质)，从而排除其他突变体。定向进化的基本规则是“获取你所筛选的突变体”。定向进化=随机突变+定向选择。4.6.3酶基因的随机突变1、易错PCR技术为代表的无性进化无性突变：向单一酶分子基因内随机引入突变，制造突变酶库以便筛选。易错PCR：从酶的单一基因出发，在改变反应条件的情况下进行聚合酶链反应，使扩增得到的基因出现碱基配对错误，从而引起基因突变的技术过程。反应条件：提高Mg2+浓度；添加Mn2+；改变四种底物浓度比等。易错PCR技术特点：操作简便，随机突变丰富。缺点：正突变基因少，需多次PCR。注意：控制好基因突变频率。适用：较小基因的定向进化。2、DNA重排技术为代表的有性进化DNA重排技术：又称DNA改组技术，有性PCR（sexualPCR）。从正突变基因文库中分离得到的同源DNA，用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。DNA改组原理DNA改组技术特点：正突变频率高，进化速度快。注意：需多次进行。3、基因家族之间的同源重组从自然界中存在的基因家族出发，利用它们之间的同源顺序进行DNA改组实现同源重组。如：Stemmer等从4种微生物中选择编码头孢菌素酶的4个同源基因，对它们进行单独进化或同源重组进化。结果对单基因进化得到的突变酶中，对头孢羟羧氧胺的抗性最高的增加了8倍，而用家族同源重组进化的方法使抗性比其中两种微生物来源的天然酶提高270倍，比另外两种酶提高了540倍。杂合酶：把来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。4.6.4酶分子定向进化的选择策略定向进化中，突变具有随机性，但通过选择特定方向的突变限定了进化趋势，加之控制实验条件，限定突变种类，降低突变率，缩小突变库的容量，这不仅减少了工作量，更重要的是加快了酶在某一方向的进化速度。筛选方法必须灵敏，至少与目的性质相关。另有一些其他的筛选方法，如加入能产生可见光信号的底物或利用绿色荧光蛋白的荧光性质等。1、突变基因文库的构建定义：将各种不同突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。质量要求：文库包容性和文库完整性过程：载体选择基因重组形成基因文库质粒噬菌体DNA黏粒载体噬菌粒载体转化转导2、突变基因的筛选（1）定向选择环境条件的设定（2）高通量筛选技术平板筛选技术荧光筛选法噬菌体表面展示法酵母细胞表面展示法举例例1：定向进化提高枯草芽孢杆菌脂肪酶的活力例2：大肠杆菌碱性磷酸酶的体外定向进化研究例3：采用易错PCR对粘质沙雷氏菌几丁质酶C进行定向进化酶性质突变方法枯草杆菌蛋白酶E有机相活性/稳定性易错PCRβ-内酰胺酶总活力/底物专一性DNA改组枯草杆菌蛋白酶BPN′稳定性盒式诱变对硝基苯酯酶底物专一性/有机相活性易错PCR/DNA改组胸腺嘧啶核苷激酶底物专一性盒式诱变β-半乳糖苷酶底物专一性DNA改组绿色荧光蛋白荧光DNA改组核酶底物专一性易错PCR/DNA改组天冬氨酸酶活性与稳定性随机/定位诱变药物和疫苗活性/专一性/最佳表达DNA改组4.6.5酶的体外定向进化应用实例4.7酶分子修饰的应用（P152-157）在酶学研究方面的应用在医药方面的应用在工业方面的应用在抗体酶研究开发方面的应用在核酸类酶人工改造方面的应用在有机介质酶催化反应中的应用4.7酶分子修饰的应用（P152-157）1、在酶学研究方面的应用酶活性中心的研究酶的空间结构研究酶的作用机制研究4.7酶分子修饰的应用（P152-157）2、在医药方面的应用降低或者消除酶的抗原性增强医药用酶的稳定性（半衰期）4.7酶分子修饰的应用（P152-157）3、在工业方面的应用提高工业用酶的催化效率提高工业用酶的稳定性改变酶的动力学特性4.7酶分子修饰的应用（P152-157）4、在抗体酶研究开发方面的应用诱导法修饰法氨基酸置换修饰侧链基团修饰等4.7酶分子修饰的应用（P152-157）5、在核酸类酶人工改造方面的应用核苷酸置换修饰核苷酸残基修饰4.7酶分子修饰的应用（P152-157）6、在有机介质酶催化反应中的应用方面的应用增强酶的疏水性提高酶活力提高酶的稳定性小结1、什么是酶分子修饰3、酶分子修饰的基本要求和条件4、酶分子的修饰方法5、酶修饰后的性质变化6、酶的定向进化7、酶化学修饰的应用2、化学修饰的原理思考题1、试述酶分子修饰的概念和作用。2、何谓大分子结合修饰？有何作用？3、举例说明肽链有限水解修饰的作用。4、何谓氨基酸置换修饰？有何作用？5、简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用。6、酶分子的物理修饰有何特点？7、何谓酶定向进化？有何特点？8、简述突变基因定向选择的基本过程。9、举例说明酶定向进化技术的应用。