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Chapter4TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的分离纯化Contentsofchapter41、酶的提取与分离纯化技术路线2、细胞破碎3、酶的提取4、酶的分离方法5、酶的精制7、酶的浓缩、干燥与结晶6、电泳技术4.1酶的分离细胞破碎酶提取酶分离纯化酶浓缩酶贮存动物、植物或微生物细胞发酵液离心分离，过滤分离，沉淀分离，层析分离，电泳分离，萃取分离，结晶分离等。酶的提取、分离纯化技术路线酶的纯化过程，约可分为四个阶段：(1)预处理（pretreatment）：包括固液分离和细胞破碎（分离胞内产物）等。(2)初步纯化（提取,roughfractionation）：除去与目的产物性质差异很大的杂质。(3)高度纯化（精制,finefractionation）：除去与产物性质相似的杂质。(4)浓缩与干燥（成品加工,concentrationanddesiccation）:使酶与溶剂分离的过程。酶分离纯化不同阶段本章目录为何要对发酵液进行预处理？发酵液的基本特性:液相粘度大，多为非牛顿型流体，不易过滤；目标产物浓度较低，大多为1-10%，成分复杂,菌丝体、代谢产物、培养基影响提取4.1.1发酵液预处理固液分离方法:过滤、离心、膜分离对于细菌及某些放线菌，菌体细小，液体粘度大，不能直接过滤，若用高速离心，能耗很大，设备昂贵。若用膜分离技术（如微滤）易产生膜污染，通量降低。发酵液中由于菌体自溶，核酸、蛋白质及其它有机粘性物质的存在也会影响固液分离。因而寻找一种经济有效的方法来提高固液分离速度显得十分必要。预处理的目的:改变发酵液的物理性质，提高固液分离的效率。预处理的过程发酵液杂质的去除蛋白质无机离子色素培养液处理性能的改善降低黏度调节pH值和温度絮凝与凝聚1.发酵液的相对纯化（1）无机离子的去除Ca2+草酸钠草酸钙Mg2+三聚磷酸钠络合物（MgNa3P3O10）Fe2+黄血盐普鲁士蓝沉淀(K4Fe(CN)6)（2）杂蛋白质的去除a.沉淀法：调pH，加入三氯醋酸等b.变性法：加热法c.凝聚和絮凝：改变胶体粒子的分散状态d.吸附法：氯化钙和磷酸氢二钠（3）色素及其它物质的去除：活性炭、大孔吸附树脂、离子交换树脂等2.发酵液的固液分离（转鼓式真空吸滤机、离心、半框压滤机）（1）影响发酵液过滤的因素a.菌种b.培养基成分（2）提高过滤性能的方法凝聚、絮凝、稀释、加热、助滤剂等细胞结构与酶分布4.1.2细胞破碎（一）细胞壁组成细胞壁的主要成分：细菌：肽聚糖(N-乙酰萄糖胺，N-乙酰胞壁酸)酵母：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白质真菌:多糖（几丁质和葡聚糖）微生物革兰氏阳性细菌革兰氏阴性细菌放线菌酵母菌霉菌壁厚/nm15~5010~13同G+100~300100~250层次单层多层多层多层主要组成肽聚糖(40%~90%)多糖胞壁酸蛋白质脂多糖(1%〜2%)肽聚糖(5%~10%)脂蛋白脂多糖(11%~22%)磷脂蛋白质葡聚糖(30%~40%)甘露聚糖(30%)几丁质(1%~2%)蛋白质(6%~8%)脂类(8.5%~13.5%)多聚糖(80%~90%)脂类蛋白质各种微生物细胞壁的结构与组成细菌细胞壁的结构酵母菌细胞壁的结构M—甘露聚糖；P—磷酸二酯键；G—葡聚糖（一）细胞破碎方法许多酶存在于细胞内。为了提取这些胞内酶，首先需要对细胞进行破碎处理。1）机械破碎2）物理破碎3）化学破碎4）酶解破碎JY92-IID超声波细胞粉碎机细胞破碎珠高压细胞破碎机DY89-I型电动玻璃匀浆机机械破碎捣碎法研磨法匀浆法物理破碎温度差破碎法压力差破碎法超声波破碎法化学破碎有机溶剂：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性剂：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制剂法通过机械运动产生的剪切力，使组织、细胞破碎。通过各种物理因素的作用，使组织、细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎。通过各种化学试剂对细胞膜的作用，而使细胞破碎通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，而达到细胞破碎细胞破碎方法及其原理本章目录细胞对破碎方法的敏感性细胞声波机械渗透压冻融————————————————————动植物++++++++++++革兰氏阴性菌++++++++革兰氏阳性芽孢菌++++++酵母++++革兰氏阳性球菌+-++菌丝-++-++孢子----（三）细胞破碎确认1.直接测定破碎前后的细胞数：破碎前，用显微镜或电子微粒计数器直接计数；破碎后，用染色法区分破碎细胞与完整细胞。2.测定导电率：利用破碎前后导电率的变化测定破碎程度。3.测定释放的蛋白质量或酶活力：测定破碎液中胞内蛋白质或目的酶的释放量，估算破碎率。把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料中引入溶液。提取目标:(a)将目的酶最大限度地溶解出来;(b)保持生物活性。注意：温度升高，溶解度加大。但为防止酶失活，一般采用低温下（0~10℃）操作。提取原则；相似相溶；远离等电点的pH值，溶解度增加。4.1.3酶的提取(extraction)提高温度，降低溶液粘度、增加扩散面积、縮短扩散距离，增大浓度差等都有利于提高酶分子的扩散速度，从而增大提取效果。为了提高酶的提取率并防止酶的变性失活，在提取过程中还要注意控制好温度、pH值等提取条件。酶提取时首先应根据酶的结构和溶解性质，选择适当的溶剂。一般说来，极性物质易溶于极性溶剂中，非极性物质易溶于非极性的有机溶剂中，酸性物质易溶于碱性溶剂中，碱性物质易溶于酸性溶剂中。酶都能溶解于水，通常可用水或稀酸、稀碱、稀盐溶液等进行提取，有些酶与脂质结合或含有较多的非极性基团，则可用有机溶剂提取。酶的主要提取方法提取方法使用的溶剂或溶液提取对象盐溶液提取0.02～0.5mol/L的盐溶液用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且稳定性较好的酶碱溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀碱溶液中溶解度大且稳定性较好的酶有机溶剂提取可与水混溶的有机溶剂提取那些与脂质结合牢固或含有较多非极性基团的酶大多数蛋白类酶都溶于水，而且在低浓度的盐存在的条件下，酶的溶解度随盐浓度的升高而增加，这称为盐溶现象。4.1.4酶的分离方法1、沉淀分离2、离心分离3、萃取分离4、过滤与膜分离5、层析分离6、电泳分离1、沉淀分离沉淀分离是通过改变某些条件或添加某种物质，使酶的溶解度降低，而从溶液中沉淀析出，与其它溶质分离的技术过程。使溶液中的溶质由液相转变为固相析出；古老、实用、简单的初步分离方法。沉淀分离方法分离原理盐析沉淀法利用不同蛋白质在不同的盐浓度条件下溶解度不同的特性，通过在酶液中添加一定浓度的中性盐，使酶或杂质从溶液中析出沉淀，从而使酶与杂质分离等电点沉淀法利用两性电解质在等电点时溶解度最低，以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性，通过调节溶液的pH值，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离有机溶剂沉淀法利用酶与其它杂质在有机溶剂中的溶解度不同，通过添加一定量的某种有机溶剂，使酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离复合沉淀法在酶液中加入某些物质，使它与酶形成复合物而沉淀下来，从而使酶与杂质分离选择性变性沉淀法选择一定的条件使酶液中存在的某些杂质变性沉淀，而不影响所需的酶，从而使酶与杂质分离（1）盐析沉淀法（改变离子强度）a:基本原理（盐溶和盐析）向蛋白质或酶的水溶液中加入中性盐，可产生两种现象：1)盐溶（saltingin）：低浓度的中性盐增加蛋白质的溶解度。2)盐析（saltingout）：高浓度的中性盐降低蛋白质的溶解度。蛋白质的盐析硫酸铵对马血红蛋白的溶解度的影响离子强度盐析盐溶原因：高盐浓度下盐离子与蛋白质分子争夺水分子，除去蛋白质的水合外壳，降低溶解度而沉淀。不同蛋白质分子量、表面电荷不同，在不同盐浓度下沉淀，逐渐增大盐浓度，不同蛋白质先后析出，称分段盐析。蛋白质分子表面的疏水区域和荷电区域1）中性盐的选择常用（NH4）2SO4，其突出优点：溶解度大分离效果好不易引起变性价格便宜b.盐析用盐2)盐浓度的表示用饱和（溶解）度表示:溶液中饱和硫酸铵的体积饱和度＝溶液的总体积3)调整盐浓度的方式饱和溶液法（添加饱和硫酸铵溶液）适用于：蛋白质溶液体积不太大，而达到的盐浓度又不太高时。配制饱和硫酸铵溶液所需添加饱和硫酸铵的体积可按下式计算：S2-S1V=V0————1-S2式中V,V0——分别为所需加入的饱和硫酸铵体积及原溶液体积S2,S1——分别为所需达到的硫酸铵饱和度和原来溶液的硫酸铵饱和度添加固体硫酸铵适用于：蛋白质溶液原来体积已经很大，而要达到的盐浓度又很高时。按下式计算，得表中数据B(S2-S1)W=——————1-AS2A,B——常数，与温度有关。实际使用时，可直接查表（各种饱和度下需加固体硫酸铵的量）。调整硫酸铵溶液饱和度计算表盐析操作低饱和度：饱和溶液滴加法。易于迅速混合均匀，一般终饱和度不超过40％。高饱和度：固体盐添加法。不会大量增加溶液体积。1）固体硫酸铵充分研细，温和搅拌中缓慢加入。2）冰箱中（4℃）放置过夜，待沉淀完全后高速离心。3）沉淀再溶解后可用超滤（ultrafiltration）、透析（dialysis）或层析（chromatography）方法脱盐。盐析曲线的制作如要分离一种新的蛋白质和酶，应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。蛋白质量(mg)或酶活力102030405060708090100硫铵饱和度％硫酸铵浓度（%）枯草杆菌-淀粉酶发酵液的盐析曲线盐析的影响因素1)离子强度和种类（介绍盐析常数）蛋白质溶解度与盐浓度之间的关系：IKSSs0loglogI：离子强度，I=∑MZ2；M：离子浓度（mol/L）；Z：离子价数S：离子强度为I时的蛋白质的溶解度（g/L）S0：离子强度为0时蛋白质的溶解度（g/L）Ks：盐析常数，是与蛋白质和盐种类有关的特性常数。Ks代表盐析效率，其含义是随着盐浓度的增加，蛋白质溶解度降低的速度，Ks越大盐析效果越好。当温度一定时，S0对于某一溶质是常数，用β表示，盐析方程式可改写为：logS=β-KsI两种盐析法：Ks分级盐析法：在一定的pH和温度条件下，利用不同蛋白质Ks的不同，通过改变离子强度或盐浓度（即改变I值）的沉淀方法。β分级盐析法：在一定离子强度下，通过改变溶液的pH及温度的沉淀方法。2)蛋白质浓度：过稀回收沉淀困难，过浓易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等电点处最易沉淀。4)温度的影响：稀盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度提高。浓盐溶液中，温度升高蛋白质溶解度下降。一般可在室温下进行。某些对温度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。（2）有机溶剂沉淀（降低介电常数）利用酶等蛋白质在有机溶剂中的溶解度不同而使之分离的方法。1)沉淀机理降低溶液的介电常数部分地引起蛋白质脱水2)常用有机溶剂丙酮乙醇甲醇，用量一般为酶液体积的2倍左右，终浓度为70%。3)优缺点：优点：1）分辨率比盐析法高2）沉淀不需脱盐3）溶剂易蒸发，沉淀易离心缺点：1）容易引起蛋白质变性失活2)有机溶剂易燃、易爆，对安全要求较高。4)影响有机溶剂沉淀的因素温度：低温（0℃）操作。pH值：尽可能靠近其等电点。离子强度：采用0.05mol/L的稀盐溶液增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度目的:防止蛋白质变性（4）蛋白质浓度：适当，一般为5〜20mg/ml（3）等电点沉淀(isoelectricprecipitation)原理蛋白质在等电点时溶解度最低不同的蛋白质具有不同的等电点使用方法单独使用较少（用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白），多与其它方法联合使用（如盐析法、有机溶剂法），因蛋白质在等电点时仍有一定的溶解度。优点：1)大多数蛋白质的pI都在偏酸性范围内2）无机酸（如磷酸、盐酸、硫酸）价格较低3）无需除掉多余酸即可进行下一步纯化缺点：酸化时，容易引起蛋白质失活（4）有机聚合物沉淀法作用机理：与有机溶剂类似，是发展