11分子诊断与临床

分子诊断与临床主要内容1.概述2.分子诊断的常用技术3.分子诊断在临床的应用4.分子诊断在应用中的问题及对策5.分子诊断的发展方向检验医学临床基础检验学临床生化检验学临床免疫检验学临床微生物检验学临床血液检验学临床寄生虫学临床分子诊断学(基因诊断=PCR?)科研平台？分子诊断学以分子生物学理论为基础利用分子生物学的技术和方法研究人体内源性或外源性的生物大分子（如DNA、RNA和蛋白）和大分子体系的存在、结构或表达调控的变化为疾病的预防、预测、诊断、治疗和转归提供信息和决策依据检验医学的分支学科之一分子诊断学的研究对象生物大分子核酸：DNA、RNA蛋白大分子体系基因细胞组织临床学诊断细胞核DNA转录翻译mRNA蛋白质血清学诊断分子诊断生化学诊断临床表现细胞膜不同诊断方法的研究对象分子诊断的策略遵循实验诊断学的基本原则不同疾病及病因采用不同方法根据检测目的开展不同层次的检测注重环境基因组学研究成果发挥在耐药性方面的潜在作用在疾病预测、健康检查、个体化治疗中的作用关注分子诊断中的医学论理和生物安全问题开发简便、快速、准确、特异、灵敏的方法二、分子诊断的主要技术低通量技术DNA分析：Southernblot、PCR、RFLP、ASO、SSCP、DGGE、DHPLC、DNA含量测定染色体分析：FISH、CGHRNA分析：ISH、Northernblot、RT-PCR蛋白质分析：IHC、Westernblot高通量技术核酸测序技术—基因诊断的金标准生物芯片(基因芯片)技术蛋白质组学技术2-DE质谱技术：MALDI-TOF组织芯片蛋白质组信息学RLFP原理FISH[NTERT-1与人着丝粒DNA片段杂交（绿），与人端粒DNA片段杂交（红）]二、几种常用的分子诊断技术1.核酸扩增2.分子克隆3.核酸分子杂交4.DNA测序5.单核苷酸多态性分析技术6.生物芯片技术7.蛋白质组学技术8.生物信息学1、PCR体外核酸扩增生物技术领域最重要四项技术之一细胞整合技术分子克隆技术蛋白工程技术模板DNA94℃变性55℃退火72℃引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经25-30次循环，目的DNA增加106-7PCR原理示意图2、分子克隆（基因克隆，基因重组）基本步骤分切接转筛含重组子的阳性克隆DNA重组体连载体+目的基因转化、筛选和鉴定阳性克隆+受体细胞全基因分切筛转3、核酸分子杂交定义不同来源的、具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下通过碱基配对原则形成双链的过程分子杂交技术的理论基础DNA（RNA）的变性与复性核酸分子杂交基本类型Southern杂交-----待测核酸是DNA片段Northern杂交-----待测核酸是RNA片段衍生类型：斑点杂交、原位杂交等Southernblot操作流程斑点杂交示意图4、DNA测序已知序列的验证性测序策略未知序列的从头测序策略随机测序法（鸟枪法、人工转座子法）定向测序法（引物测序法、互套缺失法）全基因组测序策略DNA测序常用技术链末端终止法（Sanger法）化学降解法测序新技术MALDI-TOFMS杂交测序法焦磷酸测序技术原子探针显微镜法单分子测序技术自动化测序---常规应用链末端终止法测序原理化学降解法测序原理自动化测序充分体现DNA序列自动化分析技术的简单、安全、精确、并行和高效等特点目前，自动化测序已成为DNA序列分析的主流，几乎完全取代了手工测序类型：基于单一荧光染料标记的自动化测序系统基于多种荧光染料标记的自动化测序系统单荧光多荧光（四荧光）377型DNA全自动测序仪5、单核苷酸多态性分析技术SNP：第三代遗传标志，是决定人类疾病易感性和药物反应差异性的主要因素SNP检测技术基本步骤靶序列的扩增SNP特异位点的区分方法：杂交、PCR、分子构象、酶法等数据的检测分析方法：凝胶电泳、荧光检测、基因芯片、质谱分析等主要的SNP检测方法凝胶电泳分析技术SSCP、TTGE、TGGE、DGGE分子杂交技术ASO、DASH、PNA杂交、LNA杂交荧光共振能量转移Taqman探针技术、分子信标技术、蝎状探针技术、替代探针技术PCR-SSCP6、生物芯片技术技术的核心：杂交技术实质：分子生物间特异性相互作用（互补配对）步骤：1.已知物质点样（阵列）2.加标记的待测样品，杂交3.检测4.数据分析、处理优点：高度并行性、多样化、自动化、微型化缺点：只能检测已知的大分子不能发现未知的大分子应用核酸分析（基因表达分析、基因突变检测、基因测序、基因图谱制作、多态性分析）、药物研究、蛋白质组鉴定及微生物菌种鉴定主要类型基因（DNA）芯片RNA芯片蛋白质芯片细胞芯片组织芯片芯片实验室(Lab-on-a-chip)6400点的基因芯片（面积12×14mm)7、蛋白质组学蛋白质组：一个细胞或一个组织或一个机体的基因所表达的全部蛋白质。蛋白质组学：从整体的角度，分析细胞内动态变化的蛋白质组成成分、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，提示蛋白质功能与细胞生命活动规律的相互关系。研究对象的整体性研究目标的动态性体现生命的复杂性蛋白质组学研究范畴：蛋白质与蛋白质间的相互作用蛋白质与核酸间相互作用蛋白质及其组成质点的分离、分析与鉴定蛋白质结构分析生理与病理状态或不同发育阶段的蛋白质表达差异丰富与完善蛋白质信息库蛋白质组学的常用分析技术从技术层面来讲的，它是一门综合的分析技术，主要有3个方向为蛋白质组学研究提供技术平台。1.蛋白质组分离技术：双向电泳（2-DE）2.蛋白质组鉴定技术：图像分析技术、微量测序、蛋白质质谱、氨基酸分析3.蛋白质组数据库的建立和生物信息学2-DE酵母双杂交技术的原理8、生物信息学概念：以数学、信息学、计算机学为主要手段，以计算机硬件、软件和网络为主要工具，对巨量的数量进行处理、存储、分配和解释，成为具有明确生物学意义的生物信息，并通过对生物信息的查询、搜索、比较和分析实现其研究目标（基因组信息结构的复杂性及遗传语言的根本规律律），解释生命的遗传语言，探索生命起源、生物进化的基本规律，探索细胞、器官和个体发生、发育、衰亡等生命科学中的重大问题。研究对象：生物学数据研究核心：基因组信息学生物信息学广义：使用数学和信息学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析呈指数级增长的生物数据和资料的一门学科。狭义：主要指基因组信息学，即以计算机和互联网为主要手段，采用计算机学和数学处理DNA及其编码的大分子物质的信息，寻找其规律性。流程：建立数据库，将获得的物质信息进行比较现有的数据库基因组数据库人类基因组数据库：NCBIgenome、GDB、Ensembl、Genatlas模式生物基因组数据库：SGD、MGI核酸序列数据库：GeneBank、EMBL-DNA、DDBJ、Unigene、HGMD蛋白质数据库：PIR、SWISS-PORT结构数据库：PDB、SCOP、CATH、COG功能数据库：KEGG、DIP、TRRD、ASDB中国生物信息数据库中国国家生物医学数据库中国核酸序列数据库中国核酸序列数据库中国人核酸序列统计数据库三、分子诊断在临床的应用1.单基因疾病的分子诊断2.多基因疾病的分子诊断3.肿瘤的分子诊断与预测4.感染性疾病的分子诊断5.在耐药性研究中的价值6.在个体化治疗中的应用7.分子诊断在临床的其他应用1、单基因疾病的分子诊断血红蛋白病的分子诊断肌营养不良症的分子诊断血友病的分子诊断α1抗胰蛋白酶缺乏症的分子诊断Leber`s遗传性视神经病变的分子诊断其他单基因疾病的分子诊断镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析谷氨酸(GAN)缬氨酸(GUN)HbAHbS镰状红细胞贫血基因组的PCR-RFLP电泳图DMD基因缺失的多重PCR诊断。共采用9对引物，可见患者（P）有电泳带的缺失。2、多基因疾病的分子诊断糖尿病的分子诊断家族性高脂血症的分子诊断高血压的分子诊断支气管哮喘的分子诊断皮肤的复杂疾病其他：冠心病、动脉粥样硬化、胃及十二指肠溃疡、精神分裂症、风湿病、癫痫、甲亢、唇裂、腭裂等。遗传病的基因诊断方法选择原则3、肿瘤的分子诊断与预测肿瘤的分子分类与分期肿瘤的分子标志肿瘤的分子诊断肿瘤的分子预测肿瘤的分子标志肿瘤基因的分子诊断肿瘤的早期诊断和筛选肿瘤的疗效监测肿瘤的预后判断肿瘤微转移检测主要方向4、感染性疾病的分子诊断诊断途径：感染性病原体的分子诊断感染性病原体的分型检测感染性病原体的耐药监测人感染性疾病的易感基因检测感染组学----对感染性疾病的总体性和综合性研究感染性疾病的分子诊断分子诊断方法核酸杂交技术核酸扩增技术基因定量诊断技术基因芯片技术蛋白质组学技术感染性疾病的分子诊断目前主要的应用病毒的分子检测细菌感染的分子检测衣原体的分子检测支原体的分子检测螺旋体的分子检测原虫的分子检测5、分子诊断在耐药性研究中的应用微生物耐药性的研究耐药基因的检测与分析PCR、PCR-SSCP、PCR-RFLP、核酸杂交、FQ-PCR、基因芯片等耐药菌株的鉴定与分析质粒谱DNA指纹分析、DNA的特异性位点分析、全基因DNA指纹、基因芯片分子诊断在耐药性研究中的应用肿瘤的多药耐药基因的检测与分析主要的MDR基因mdr1---------p-蛋白MRP---------多药耐药相关蛋白LRP----------肺耐药相关蛋白TopoⅡα----DNA拓扑异构酶Ⅱα同工酶GSTp1--------谷胱甘胱S-转移酶P1-1同工酶6、在个体化医疗中的应用个体化医疗个体化医疗的前提药物基因组学与个体化用药肿瘤的个体化治疗7、分子诊断的其他应用在移植配型中的应用在法医学中的应用在产前诊断中的应用在新生儿筛查中的应用在预防医学检验中的应用RFLP在法医学中的应用四、分子诊断在应用中的问题及对策1.在感染性疾病检测中的问题与对策2.易感基因诊断中的问题与对策3.肿瘤的分子诊断和预测的问题与对策4.分子诊断中的伦理问题5.分子诊断中的质量问题与标准化1.在感染性疾病检测中的问题与对策问题：病原微生物日益复杂新病原体的出现耐药株的出现对策：开发快速、准确、特异、灵敏的新方法新方法与传统方法、实验室检查与临床表现结合多种方法联合应用开发新方法，加强耐药性检测利用人易感基因检测进行诊断（如SNP）2、易感基因诊断中的问题与对策问题：遗传异质性多因素复杂性假阳性存在拟表型各种因素导致的误导易感基因诊断中的问题与对策对策提高关联性检测的可能性选择单体型作为标志利用LD、tagSNP和单体型进行关联研究采用大样本研究提高关联研究的效应同时检测多个遗传标志根据环境因素和多基因因素进行分析利用易感基因进行健康预测的问题单基因疾病：检测相关基因或染色体畸变做健康预测，或产前诊断-----可信的易感基因：只能作有限的参考原因：易感基因的研究和检测技术正处发展过程中并非所有疾病都可以预测现阶段发现的部分疾病的易感基因还难以直接应用于临床治疗和预防3、肿瘤分子诊断的问题与对策癌基因的激活、抑癌基因的失活（或缺失）原癌基因细胞癌基因病毒癌基因生长因子及受体、蛋白激酶、转录因子等肿瘤抑制基因肿瘤转移相关基因肿瘤耐药基因等癌基因或抑癌基因在正常细胞的基因组中存在表达/不表达状态表达程度肿瘤标志的特异性易感基因的关联性肿瘤分子诊断的问题与对策4、分子诊断中的伦理问题医学论理学的一般原则：有利、无害、公正、尊重遗传服务：一种面向社会的应用遗传技术的医学实践需遵守医学伦理学实施依赖于分子诊断技术内容：遗传咨询、遗传检查、遗传筛查、基因治疗、辅助生殖等主要途径：基因检查、染色体检查个人遗传信息的不当使用遗传歧视5、分子诊断