15药物遗传毒性

第十五章药物的致突变作用第一节基本概念突变(mutation)由环境因素突然改变所引起的生物遗传物质变化，最终导致生物遗传信息的改变。群体：遗传结构变化；个体：表型变化。是遗传物质的一种可遗传的变异。遗传结构：种群中占主导地位的交配方式和基因的遗传特性。种群中的基因多样性取决于基因突变、基因重组和外界种群的基因流入。自发突变(spontaneousmutation)由于自然界中环境因素的作用或由于偶然的自制、转录、修复时的碱基配对错误所产生的突变。自发突变(spontaneousmutation)的发生率很低，它提供了生物进化的基础。致突变作用或诱变作用(mutagenesis)环境因素引起生物体发生突变的作用及过程称为致突变作用或诱变作用。环境中存在的可诱发突变发生的因素包括化学因素(各种化学物质)、物理因素(如电离辐射)和生物因素(如病毒)。在此特指由于人为因素导致的生物体生存环境剧烈变化的因素。化学诱变剂(chemicalmutagen)凡能引起致突变作用的化学物称为化学诱变剂(chemicalmutagen)。直接诱变剂(direct-actingmutagen)其原型或其化学水解产物就可以引起生物体突变的物质。间接诱变剂(indirect-actingmutagen)其本身不能引起突变，必须在生物体内经过代谢活化才呈现致突变作用的物质。基因突变一个或几个DNA碱基对的改变。染色体畸变染色体的结构及数目改变。端粒姊妹染色单体着丝粒组蛋白双螺旋碱基对端粒腺嘌呤胸腺嘧啶鸟嘌呤胞嘧啶DNAmRNAmRNA肽链氨基酸蛋白质的合成核苷酸三联体RNA氨基酸密码子表甘氨酸精氨酸精氨酸色氨酸半胱氨酸酪氨酸组氨酸酪氨酸脯氨酸谷氨酸苯丙氨酸异亮氨酸甲硫氨酸缬氨酸赖氨酸丙氨酸亮氨酸亮氨酸丝氨酸丝氨酸谷氨酰胺天冬酰胺天冬氨酸A：腺嘌呤；U：尿嘧啶；G：鸟嘌呤；C：胞嘧啶。A＝U，G≡C。细胞一次分裂结束，并开始生长，到下一次分裂终了所经历的过程。细胞周期G0：DNA合成前期；G1：DNA合成期；S：完成DNA复制；G2：为有丝分裂做准备；M：有丝分裂期有丝分裂的过程PREMETAPHAES中心粒核仁核核膜染色质丝间期染色质复制早前期染色体形成。中心粒移向两极。前中期中心粒染色体染色体纺锤丝染色体在赤道板排列中期中期中期后期末期间期中期后期中期后期有丝分裂减数分裂第二节突变的类型一、基因突变(genemutation)1、碱基置换(base-pairsubstitution)某一碱基配对性能改变或脱落所致的突变。•转换(transition)•颠换(transvertion)2、移码突变(frameshiftmutation)发生一对或几对（三对除外）的碱基减少或增加，以致从受损点开始碱基序列完全改变，形成错误的密码，并转译成为不正常的氨基酸。二、染色体畸变(chromosomeaberration)染色体的结构改变1、染色单体型畸变2、染色体型畸变染色体畸变裂隙(gap)断裂(break)断片(fragment)和缺失(deletion)微小体(minutebody)无着丝点环环状染色体双着丝点染色体倒位(inversion)易位(translocation)插入(insertion)和重复(duplication)辐射体染色体缺失环状染色体染色体插入染色体重复染色体臂间倒位染色体相互易位a.染色单体断裂b.三辐射体c.染色体断片d.双着丝点染色体e.环状染色体f-g.无着丝点断片三、基因组突变物种体细胞性细胞人4623大鼠4221小鼠4020猫3819兔4422狗7839不同物种动物的染色体1、非整倍体指细胞丢失或增加一条或几条染色体。缺失一条称为单体(monosome)，增加一条称为三体(trisome)。染色体数目的改变会导致基因平衡的失调，可能影响细胞的生存或造成形态及功能上的异常。如21三体导致先天愚型(Down氏综合征)。2、整倍体指染色体数目的异常是以染色体组为单位的增减，如三倍体(triploid)、四倍体(tetroploid)等。在肿瘤细胞及人类自然流产的胎儿细胞中常有三倍体细胞的存在。发生于生殖细胞的整倍体改变，几乎都是致死性的。一、致突变作用机制——DNA损伤或缺失导致遗传信息的改变1、碱基错配2、碱基类似物的取代3、碱基的化学结构改变或破坏4、嵌入DNA链5、DNA结构的损伤6、有丝分裂的干扰第三节致突变作用机制和后果T:A5-BrU:A5-BrU:G碱基错配碱基类似物的取代TyrGlySerArgProThrAsp二、突变的不良后果突变体细胞突变生殖细胞突变癌变致畸衰亡配子死亡流产或死胎显性存活隐形存活遗传给子代三、机体对突变的修复DNA修复直接修复切除修复O6甲基鸟嘌呤甲基转移酶二聚体光解酶错配碱基修复碱基切除修复核苷酸切除修复复制后修复呼救性修复嘌呤插入酶DNA连接酶第四节遗传毒理学的实验方法一、遗传毒性实验的选择（一）遗传学终点及其类型1、遗传学终点(geneticendpoint)试验观察到的现象所反映的遗传物质的各种改变。如，基因突变、染色体畸变、染色体分离异常。⑴DNA完整性的改变；⑵DNA重排或交换；⑶DNA碱基序列改变（基因突变）；⑷染色体完整性改变（染色体畸变）；⑸染色体分离改变。国际环境致突变物致癌物防护委员会(ICPEMC)于1983年提出致突变试验的遗传学终点：2、遗传学终点的类型（二）主要的遗传毒理学试验1、最常用的试验遗传终点遗传毒性实验基因突变试验鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验(Ames试验)哺乳动物体内染色体损伤试验啮齿类骨髓染色体畸变试验或微核试验遗传终点遗传毒性实验基因突变试验大肠杆菌WP2色氨酸回复突变试验；培养哺乳动物细胞TK或HPRT正向突变试验；果蝇伴性隐性致死试验染色体畸变试验培养中国仓鼠或人体细胞细胞遗传学分析染色体畸变和微核试验非整倍体试验其他遗传终点酵母和果蝇有丝分裂重组试验培养肝细胞及啮齿类程序外DNA合成试验哺乳动物生殖细胞试验小鼠精子形态及电泳特异座位试验骨骼或白内障突变试验细胞遗传学分析及可遗传易位试验啮齿类生殖细胞DNA损伤和修复试验显性致死试验2、在评价突变危害中常用的有特殊重要意义的试验二、遗传毒性实验的组合（一）原因遗传毒理学评价程序通常为一组体内、外遗传毒理学试验。——单一的实验不能全面的检测各种遗传终点的变化，容易出现假阴性结果。①化学毒物的致突变机制不尽相同；②作用的靶部位不尽相同；③有直接致突变作用和间接致突变作用。•应包括5类遗传学终点•应包括多种进化程度不同的物种•体内试验与体外试验配合•体细胞试验阳性，再进行生殖细胞试验•验证阳性结果在体内的真实性，必要时再选用生殖细胞致突变试验（二）组合原则国际协调组织(1997)对于药品的遗传毒性评价建议的检测试验组合为：①细菌基因突变试验；②体外哺乳动物细胞染色体畸变试验或体外小鼠淋巴瘤细胞比试验；③体内啮齿类造血细胞染色体损伤试验(骨髓细胞染色体畸变试验或骨髓或外周血多染红细胞微核试验)。在三项标准试验中为阴性的化学物，通常可认为其无遗传毒性作用。但对于构效关系显示有可能具致癌性或致突变性，但在三项标准试验中为阴性的化学物，还需要改进试验方法或再增加试验项目。我国《新药审批办法》中要求在新药临床前特殊毒理学评价中应包括致突变试验、生殖毒性试验（致畸试验）、致癌试验和药物依赖性试验。其中致突变试验的基本试验方法有三种：①鼠伤寒沙门氏菌回复突变试验（Ames试验）；②哺乳动物培养细胞染色体畸变试验；③小鼠骨髓微核试验。上述三项致突变试验结果全部阴性时，则不必往下进行。我国卫生部在《食品安全性毒理学评价程序》(1994)中对致突变试验的要求是：根据受试物的化学结构、理化性质以及对遗传物质作用终点的不同，兼顾体外和体内试验，体细胞和生殖细胞的原则，进行①Ames试验；②小鼠骨髓微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验；③小鼠精子畸形试验；④睾丸染色体畸变试验。如果有一项试验为阳性，还应在其他备选试验(V79细胞HGPRT基因突变试验，显性致死试验，果蝇伴性隐性致死试验，UDS试验)中再选择两项试验进行。我国《农药安全性毒理学评价程序》(1991)中对遗传毒理学试验的要求则为：Ames试验和大肠杆菌回复突变试验，骨髓细胞微核试验或骨髓细胞染色体畸变试验，睾丸细胞染色体畸变试验或显性致死试验为必做项目。其中有一项出现阳性，还需从精子畸形试验、体外培养细胞染色体畸变试验、UDS、果蝇伴性隐性致死试验等试验中再选择两项进行。三、常用的致突变试验鼠伤寒沙门氏菌原养型(his+)组氨酸营养缺陷型突变株。(his-)正向突变回复突变±代谢活化系统受试物(一)Ames试验1、原理2、常用菌株⑴TA97，移码突变；⑵TA98，移码突变；⑶TA100，碱基置换；⑷TA101，碱基置换；微核(Micronucleus)是存在于细胞胞质中的染色体（断片、单体、整个染色体），染色与细胞核一致，体积比主核小，故称微核。其来源有二：①断片或无着丝粒染色体在细胞分裂后期不能定向移动，而遗留在细胞质中；②有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中。微核试验的检测终点是DNA断裂剂和非整倍体诱变剂。(二)微核试验(Micronucleustest，MNT)MNNCE制备细胞分裂中期相染色体标本，在光镜下可直接观察染色体的数目和形态的改变。染色体畸变试验也常称为细胞遗传学试验(cytogeneticassay)。染色体畸变试验可为体外试验，也可为体内试验，包括对体细胞和生殖细胞的分析。（三）染色体畸变试验(chromosomeaberrationtest)观察裂隙、断裂、断片、无着丝粒环、染色体环、双或多着丝粒染色体、射体和染色体粉碎1、体外染色体畸变试验(invitrochromosomeaberrationtest)常用的分析细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、中国仓鼠肺(CHL、V79)细胞及外周血淋巴细胞等。染色体结构异常主要可观察到裂隙、断裂、断片、缺失、微小体、着丝点环、无着丝点环及各种辐射体等。染色体数目异常包括多倍体及非整倍体。2、体内染色体畸变试验(invivochrosomeaberrtiontest)主要有啮齿类动物骨髓细胞染色体畸变试验(chromosomeaberrationofbonemarrowcells)和啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验(chromosomeaberrationtestoftesticlecells)。在啮齿类动物睾丸细胞染色体畸变试验中，常用的有精原细胞及初级精母细胞染色体畸变试验。细胞培养液中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-BrdU)，在DNA合成期可与胸苷竞争掺入DNA中。经过一次有丝分裂后，仅在新合成的互补链中有5-BrdU的掺入；再经过一次有丝分裂，则一条单体中两条DNA链均有5-BrdU的掺入，而另一条则仅一条DNA链中有5-BrdU的掺入。由于5-BrdU对染料的亲合力下降，染色后会出现一深一浅两条姐妹染色单体。如果有交换发生就可在光镜下计数SCE，评价DNA的断裂和重接。(四)姐妹染色单体交换试验(sisterchromatidexchageassay，SCE）(五)哺乳动物体细胞株突变试验常用的细胞株有中国地鼠肺细胞V79、中国地鼠卵巢细胞株(CHO细胞株)以及小鼠淋巴瘤L5178Y细胞株。这些突变细胞缺乏次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)或胸苷激酶(TK)，在DNA合成中不受碱基类似物的毒害。如果发生回复突变，则不能存活。正常细胞6-巯基嘌呤(MP)6-硫代鸟嘌呤(TG)8-氮杂鸟嘌呤(AG)5-溴脱氧尿苷(5-BrdU)突变细胞突变细胞回复突变受试物用于检测哺乳动物性细胞基因突变的形态学方法。T系小鼠带有7个与毛色、眼色及耳形有关的隐性基因座。C57BL(或3H1)小鼠有相应的显性基因。杂交后所产子代的隐性基因不能表达。将受试物染毒处理的C57BL(或3H1)小鼠与T系小鼠杂交，若受试物可引起小鼠生殖细胞等